細胞凋亡檢測(單染法)

實驗概要

本實驗介紹了細胞凋亡檢測(Annexin-V-FITC 單染法)(Assay of Cell Apoptosis)的原理及操作流程。

實驗原理

細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed  Cell  Death，PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，  PS）位于細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS  從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²  依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

主要試劑

1. Annexin V-FITC（膜聯蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml
2. 標記緩沖液（Binding Buffer）40/20 ml
3. PBS（1×） 60/30 ml

主要設備

1. 20μl，200μl，and 1000μl 移液器和吸頭
2. 微量離心管
3. 可調速離心機
4. 載玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
5. 蓋玻片（用于熒光顯微鏡觀察）
6. 去離子水
7. 冰塊
8. 流式細胞儀或熒光顯微鏡

實驗材料

小鼠

實驗步驟

1. 凋亡細胞的制備：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg體重，10h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調整待測細胞的濃度為2 ×10⁶/ml，備用。
2. 200μl細胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm 4℃離心10min。

3. 重復步驟2兩次。
4. 將細胞重懸于200μl 標記緩沖液。
5. 加入10μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘或4℃反應30分鐘。
6. 加入300μl標記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。

注意事項

1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。
2. 反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。