美國研究所基于冷凍電鏡揭示新冠病毒的恐怖親和力

　　 美國國家過敏和傳染病研究所疫苗研究中心最近提交的一篇論文對新冠病毒結構進行了研究，并驗證了一個結論：新冠病毒 S 蛋白與細胞 ACE2 的親和力是 SARS 的 10 到 20 倍。

　　這可能意味著新冠病毒肺炎（COVID-19）的傳染性相比 SARS 要高出很多。

　　這篇最新論文目前被發布在生物領域預印版論文平臺 bioRxiv 上。其中，研究人員通過低溫電子顯微鏡構建了新冠病毒 S 蛋白的預融合構架是三個聚體，發現每個單體上都有細胞受體結合點位。

　　對比新冠與非典的 S 蛋白，研究人員驚訝的發現，新冠病毒和人血管緊張素轉化酶 2（ACE2）的結合力是 SARS 病毒的 10-20 倍。

　　這是科學家們首次對于新冠病毒刺突蛋白冷凍電鏡結構進行詳細觀察揭示的秘密。

　　冠狀病毒的刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）是疫苗、治療性抗體的研發以及臨床診斷的關鍵靶點。

　　2020 年 2 月 15 日，美國衛生總署 (NIH) 與德克薩斯大學奧斯汀分校 Jason S. McLellan 研究組（此前，McLellan 組在病毒結構方面做了很多重要的工作，研究涉及 MERS 等疾病）進行合作，利用冷凍電鏡技術分析了新型冠狀病毒表面 S 蛋白的近原子結構。這一研究揭示了新型冠狀病毒傳染性強的主要原因。

　　新型冠狀病毒大爆發已被宣布為國際關注的突發公共衛生事件。新冠病毒的 S 突刺蛋白也成為疫苗、治療性抗體研發和診斷的關鍵靶點。

　　在這篇研究中，研究人員獲得了處于預融合構象的新型冠狀病毒突刺蛋白三聚體的冷凍電鏡（cryo-EM）結構，其分辨率為 3.5?。三聚體的主要狀態為三個受體結合結構域（RBD）之一向上旋轉為受體可及構象。

　　生物物理和結構證據表明，較之 SARS 冠狀病毒，新型冠狀病毒的三聚體更容易與細胞表面的 ACE2 蛋白結合。另外，研究者們也測試了幾個已經發表過的 SARS 冠狀病毒 RBD 特異性單克隆抗體，發現它們與新冠病毒 S 突刺蛋白沒有明顯的結合，這表明兩種病毒 RBD 之間的抗體交叉反應性可能受到限制。

　　新型冠狀病毒利用高度糖基化的同源三聚體 S 蛋白進入宿主細胞。S 蛋白經歷結構變化將病毒融合進入宿主細胞的細胞膜。

　　此過程包括病毒的 S1 亞基結合到宿主細胞受體上，引發三聚體不穩定性的發生，進而造成 S1 亞基脫落 S2 亞基形成高度穩定的融合后結構。

　　為了與宿主細胞受體結合，S1 的受體結合域 (RBD) 經歷了類似于鉸鏈的融合構象運動，以暫時隱藏或暴露受體結合的關鍵位點。這兩種狀態被稱為「下」構象和「上」構象，其中，「下」對應于受體不可結合狀態，「上」對應于受體可結合狀態，而受體可結合狀態被認為較為不穩定。

　　由于 S 蛋白的不可或缺性，它是抗體介入中和的一個脆弱靶點，而預融合 S 結構的特性將為指導疫苗的設計和開發提供原子水平的信息。

圖 1. 預融合構象中的 2019-nCoV S 蛋白結構。

　　根據新型冠狀病毒公布的基因序列，研究者表達了 S 突刺蛋白的胞外域殘基（ectodomain residues）1?1208（見圖 1A 和補充材料圖 1），在基于先前的穩定策略的 C 末端 S2 融合機制中增加了兩個穩定脯氨酸突變，該策略被證明對β冠狀病毒 S 蛋白高效。

　　研究者從 FreeStyle 293 細胞中獲得了大約 0.5 毫克/升的重組預融合穩定的 S 胞外域，通過親和層析和凝膠排阻層析進行體外蛋白純化（補充材料圖 1）。使用這種純化的、完全糖基化的 S 蛋白制備冷凍電鏡網格，初步篩選顯示高顆粒密度，在孔的邊緣幾乎沒有聚集。

圖 2. 2019-CoV 病毒 S 蛋白與 SARS-CoV 病毒 S 蛋白的結構比較。

　　最近的研究表明，新型冠狀病毒和 SARS 冠狀病毒的 S 蛋白具有相同的功能性宿主細胞血管緊張素轉受體（ACE2），這促使我們對于通過表面等離子共振（SPR）的動力學進行量化研究。令人驚訝的是：新冠病毒的 ACE2 胞外域吸引力約為 15nM，相比 SARS 冠狀病毒 S 蛋白要高出 10-20 倍。

　　研究人員還生成了新型冠狀病毒 S 蛋白胞外域 ACE2 結合的復合物，并通過負染色對其進行了觀察。它與 SARS 冠狀病毒 S 蛋白和 ACE2 之間形成的復合物非常相似。新冠病毒對于人類 ACE2 的高親和力，可能有助于使它在人與人之間的傳播變得更加容易，但論文作者認為，還需要進一步的研究來研究這種可能性。

新冠病毒（上）和 SARS 病毒（下）的 S 蛋白與 ACE2 的親和力比較

　　由于新型冠狀病毒與 SARS 病毒之間的結構同源性，研究人員希望對已經發表的 SARS 病毒的 RBD 單克隆抗體對新型冠狀病毒的 RBD 進行交叉反應性測試。

　　不過，盡管兩病毒 RBD 之間結構高度相似，SARS 病毒的 RBD 抗體對于新型冠狀病毒并沒有明顯的結合。SARS RBD 的單克隆抗體對于新型冠狀病毒不具有交叉反應，該結果與為新型冠狀病毒 S 突刺蛋白作為未來抗體分離與治療方案的設計提供了重要的參考。

　　這項研究從近原子水平的分辨率解析了新型冠狀病毒 S 蛋白，為進一步精確地疫苗設計以及抗病毒藥物的發現提供了重要的結構生物學基礎，為后續對抗新冠的疫苗和抗病毒藥物研發提供了重要的結構生物學數據支撐。