腫瘤細胞體外傳代培養及保種

實驗材料 腫瘤細胞

試劑、試劑盒 液氮EDTA保種液

儀器、耗材 恒溫水浴鍋低溫離心機方瓶CO2培養箱-70度冰箱彎管顯微鏡離心管濾膜

實驗步驟

一、細胞復蘇與培養

將液氮或-80℃保存的腫瘤細胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培養基混勻已融化的腫瘤細胞懸液, 于1500 轉/分, 離心3 分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml 培養基質混勻細胞沉淀, 再1500 轉/分, 離心3 分鐘, 棄上清, 細胞沉淀用1.0ml 培養基混勻, 備用。另取一個75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培養基質, 將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培養。若此腫瘤細胞懸浮生長, 大約3－4 天細胞基質會變黃, 5.0ml 細胞懸液可傳代一個方瓶培養, 可用3－4 個方瓶培養, 一個方瓶中呈對數生長的腫瘤細胞可達1—1.5×107 個, 根據試驗所需, 可決定傳代的次數。若此腫瘤細胞呈貼壁生長, 經過3—4 天, 腫瘤細胞生長至80%—95% 單層時, 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細胞大約3—5 分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當90% 的腫瘤細胞變圓時, 即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml 離心管中, 于1500 轉/分下，離心3 分鐘, 棄上清, 加少許培養基混勻, 可傳代3 個75cm2 方瓶擴大培養。

二、細胞凍存

將對數生長的腫瘤細胞用1 個75cm2 方瓶按上述方法收集, 于1500 轉/分離心3 分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻, 分別加入到2—3 只保種管中, 寫上腫瘤細胞名稱, 時間, 保種者姓名, 放-80℃保存, 次日將它們轉移到液氮中保存(注: -80℃下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞5—10 年, 甚至更長的時間)。以上所有物品均需經過高溫滅菌( 121℃, 30 分

鐘)，培養基質則經過過濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守無菌操作技術, 避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。