胚胎干細胞培養標準操作規程(SOP)

一、細胞

多能性胚胎干細胞產生于小鼠胚泡

1．表達綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細胞。由Dr. Nagy的實驗室制備。
　　2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時大約傳了17代。
　　3．J1-由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。我們得到時大約傳了7－9代。
　　4．J1rtTA-rtTA表達J1細胞，由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。
　　5．表達黃色熒光蛋白的YC5-ES細胞，由Dr. Nagy的實驗室提供。

二、一般培養——維持ES細胞處于未分化狀態

ES細胞培養用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2－3天從達到 80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養。

培養基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液

DMEM(高糖) 
　　馬血清（HS） 
　　L-谷氨酰胺（200mM） 
　　MEM NEAA（10mM） 
　　HEPES（1M） 
　　β-巰基乙醇（55Mm） 
　　PEST 
　　ESGRO

復蘇細胞

細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

步驟

1．從液氮中取出一管細胞；
　　2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；
　　3．將細胞轉移到一15ml Falcon管中；
　　4．加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）；
　　5．離心3分鐘；
　　6．棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次；
　　7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養皿；
　　8．孵育。