膠質瘤微環境相關研究

　　腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤。采用手術、大劑量化療和放療等綜合措施治療能取得較好的治療效果，但其總體預后仍較差，尤其是惡性程度較高的膠質母細胞瘤。膠質瘤干細胞（GSC）在膠質母細胞瘤對抗常規治療以及腫瘤復發中可能起關鍵作用。此外，GSC所處的腫瘤微環境與GSC的發生發展有關，這為膠質瘤的治療提供了一個全新思路。本文重點綜述了GSC相關腫瘤微環境的研究進展及通過靶向微環境治療膠質瘤。

　　1.膠質瘤臨床治療現狀

　　膠質瘤是最常見的成人原發性腦腫瘤，膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性程度和死亡率最高的膠質瘤亞型。目前膠質瘤常規治療手段是手術大部切除并輔以放療和替莫唑胺化療，但患者的預后較差。

　　研究發現，GBM中存在膠質瘤干細胞亞群（glioma stem cells ubpopulation，GSCs），對化療和放療具有較強的抗性，提示GSCs可能是GBM治療失敗和高復發率的原因。GSCs被認為是膠質瘤治療的重要靶標，通過靶向與GSCs發生發展密切相關的微環境是否可以特異性殺傷GSCs有待深入研究。了解GSCs與微環境相互作用的機制可以為膠質瘤的治療提供新的思路。

　　2.膠質瘤干細胞微環境研究

　　GSC的特征維持和功能發揮與其所處的微環境密切相關。目前認為膠質瘤復發主要是由GSC引起，分離的GSCs表現出耐受化療與放療的特性，表達高水平的干細胞細胞標志物，且具有高度侵襲性。GSC具有自我更新和不斷增殖的能力，在腫瘤細胞亞群中占少數。GSC在血管豐富和缺氧微環境區域聚集并高表達干細胞表面標志物如CD133和CD44。顱內注射CD133+GSC細胞使腫瘤侵襲性增強。

　　另外，CD133+GSC細胞經放療后增多，并且CD133的高表達往往預示著患者較差的預后。同樣，CD44也具有增強GSCs發展的作用。現有研究表明，與GSCs發生發展密切相關的微環境主要有兩種，即缺氧微環境和血管周圍微環境。以下本文將進一步論述缺氧微環境和血管微環境與膠質瘤干細胞的關系。

　　2.1膠質瘤血管微環境有助于GSC特性維持

　　GBM能通過增殖內皮細胞（EC）促進微血管增生。血管的生成對于腫瘤的發生發展至關重要。GSC通常在富集腫瘤血管的微環境中聚集；GBM腫瘤的免疫組織化學染色顯示，CD31+EC周邊有CD133+GSCs的聚集。GSC通過分泌血管內皮生長因子（VEGF）誘導EC遷移和血管生成，進而促進腫瘤發生。

　　血管生成對于GSCs功能維持的重要性在抑制VEGF生成的臨床前期研究中得到證實，血管內皮因子抗體貝伐單抗能消耗腫瘤脈管系統和特異性地抑制由GSC衍生的異種移植物在小鼠體內的生長。GSC通過CXCL12/CXCR4配體/受體結合誘導分泌VEGF。CD133+GSCs通過CXCL12相關的PI3K/Akt途徑促進VEGF的生成。CXCR4拮抗劑與PI3K抑制劑LY294002可以減少腫瘤VEGF的產生和抑制由GSC誘導形成的腫瘤異種移植物的生長和血管生成。此外，抑制CXCR4信號傳導能夠抑制GSCs的侵襲性和使腫瘤細胞對放射治療敏感。

　　內皮細胞能夠分泌幾種促進GSCs存活和侵襲性的因子。例如，血管生成素（Ang1）-Tie2受體相互作用在維持GSCs侵襲性中起關鍵作用。由EC衍生Ang1與酪氨酸激酶Tie2受體作用能促進GSC上黏附蛋白的表達，包括N-鈣粘蛋白和整合素β1，從而促進GSC侵襲。整合素β1對GBM彌漫浸潤至關重要。此外在血管微環境中，由CD31+ECs分泌的Shh分子通過激活Patched1和GLI信號通路以促進體內GBM腫瘤生長和GSC的自我更新。抑制Shh-GLI信號能減少GSC自我更新和體內腫瘤發生，提示Shh對GSC的生存很重要。

　　GSCs可以與微環境中的血管細胞相互作用，這種相互作用能夠維持和促進腫瘤生長并促進血管生成。L1CAM是一種神經黏附分子，能夠調節腫瘤細胞的生長和遷移，在GBM中過表達，并且是GSC存活和增殖必需的。GSC直接與ECs相互作用誘導EC遷移，并促進血管生成通過L1CAM-整合素αvβ3通路。敲除L1CAM會導致Olig2表達下調，使GSCs的擴散和功能維持被抑制。此外，激活的Notch信號能增強GSC的自我更新和侵襲性。

　　GBM免疫熒光染色證明GSCs表達高水平的Notch1和Notch2受體與鄰近的ECs密切相關。EC表達Notch受體的配體DLL4和JAGGED1GSCs，通過與Notch受體作用而促進GSC的自我更新。EC分泌的一氧化氮也能活化Notch信號，導致GSC自我更新增強和誘導膠質瘤發生；用γ-分泌酶抑制Notch信號傳導可導致GSC自我更新減少。在血管微環境中消除ECs能減弱GSC對輻射治療的抗性。

　　2.2缺氧因子誘導GSC的生存

　　缺氧在腫瘤的發生、轉移、侵襲和治療耐受中起關鍵作用。健康腦組織中氧氣濃度范圍為12.5%~2.5%（PO2=200~100mmHg，1mmHg=0.133kPa），絕大多數GBM存在不同程度缺氧，其氧氣濃度介于2.5%~0.5%。從缺氧區遷移出來的GBM檢測出高水平的GSC標志物。GSC通常位于腫瘤壞死區周圍，缺氧的環境可以促進和維持其干細胞特征及其耐藥性。細胞對缺氧微環境的反應很大程度上受到缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）的轉錄因子調節。HIF-2α的表達隨著缺氧程度增加而增強，CD133表達與其相關，并且HIF-2α能夠提高GSCs的自我更新能力。

　　HIF-2α在GSCs中誘導干細胞標志物表達，包括Sox2、Oct4和c-Myc。缺氧還可誘導HIF-1α的表達，HIF-1α的高表達能增強膠質瘤細胞的侵襲能力。由缺氧介導的HIF-1α激活Notch途徑是維持GSCs特性所必需的。抑制HIF-1α或Notch通路能抑制缺氧介導的維持GSCs特性能力。此外，HIF-1α還可以穩定Notch蛋白的胞內結構域，從而激活Notch信號通路。

　　與之類似，Wnt通路的相關蛋白也出現高表達，其與腫瘤的侵襲及增殖等密切相關。研究表明，低氧促進Wnt通路表達，從而促進膠質瘤細胞的增殖。事實上，由缺氧介導的Notch通路激活能導致E-鈣粘蛋白表達所引起的腫瘤細胞入侵能力減弱。因此，抑制Notch表達能阻斷由低氧所誘導的腫瘤侵襲，從而促進GSC凋亡。

　　3.以微環境為靶點治療膠質瘤

　　3.1以血管微環境為靶點治療膠質瘤

　　據報道，GSCs能釋放高水平的VEGF，促使新生成EC遷移到腫瘤并促進血管生成。成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）有助于保持GSCs的干性，從GSCs細胞系中敲除FGF-2，導致GSCs分化。內皮介導的信號傳導途徑的研究揭示了雷帕霉素（mTOR抑制劑）可能是重要的靶點治療組成。抑制mTOR（藥理學上用雷帕霉素，PP242和PI103，或用siRNA）能終止內皮細胞介導的GSC發生和發展。

　　通過GSC與內皮細胞的顱內共植體觀察到腫瘤生長顯著加速，并且CD133+GSC的數量顯著增加。貝伐單抗是一種抗血管生成劑，通過抑制VEGF起作用，消耗腫瘤脈管系統，從而顯著減少腫瘤CD133+GSC的數量；同時也能顯著減小腫瘤大小。初步觀察指出，源自CD133+GSC植入的腫瘤伴有顯著增多的血管，并且通過檢測VEGF，發現GSC主要通過VEGF促進血管生成。

　　抗VEGF抗體貝伐單抗抑制GSC對內皮細胞的影響并抑制腫瘤生長。VEGF特異性單克隆抗體貝伐單抗能阻斷VEGF與VEGFR2的結合，從而抑制血管生成。然而，有學者指出VEGF拮抗不足以抑制新的GSCs血管微環境形成，因為它能增加FGF1、FGF2和CXCL12等促血管生長因子的表達和補充骨髓衍生細胞促進血管生成。研究也顯示了通過ATRA抑制VEGF，隨后的研究發現GSC培養物表達高水平的基質衍生因子-1（SDF-1）；用小分子SDF-1拮抗劑處理的膠質瘤小鼠（AMD3100）體內血管生成被顯著抑制。抗血管生成和細胞毒素治療的組合能夠抑制GSC生長，這在進行的臨床試驗以測試單獨使用抗VEGF藥物和聯合細胞毒藥物治療的實驗中得到證實。

　　目前，通過抑制血管生成、靶向血管微環境的療法被認為是一種比較有應用前景的治療方法，其主要是通過減少血管生成直接阻斷血液營養物質向腫瘤組織的輸送。

　　3.2以缺氧微環境為靶點治療膠質瘤

　　在GBM中，缺氧與患者預后不良相關，這亦是干細胞所處微環境的重要性之一。缺氧促進GSCs自我更新、增殖以及致瘤性，并誘導非GSC獲取干細胞特性。缺氧刺激HIF家族的表達，導致促血管生長因子的產生。因此，缺氧微環境在GSCs的維持和擴增中具有關鍵作用。

　　在缺氧環境中，神經干細胞促進HIF-1a表達，其反過來上調VEGF的表達以刺激血管生成并使微環境重新正常化。VEGF的阻斷劑可部分逆轉由HIF-1α表達增加所引起的作用。缺氧可以增加GSC干性并且使GSC干細胞表面標志物（如CD133、A2B5、Nestin、Oct4和Sox2）上調，并使分化標志物（例如神經膠質纖維酸性蛋白）的表達下調，使GSC增殖速率和自我更新的能力也顯著增加。

　　在嚴重缺氧情況下，HIF-1α和HIF-2α在GSC中的表達上調。缺氧程度影響缺氧誘導因子的表達，在較溫和的缺氧（即7%的氧氣）與最低限度缺氧微環境中的HIF-1α和HIF-2a表達上調。在缺氧環境中，HIF-1a在GSC與非GSC和神經干細胞的上調的機制相同。然而，HIF-2a在GSC中的表達具有特殊性。HIF-2a的表達與HGG患者的生存相關。

　　值得注意的是，HIF-2a在常氧條件下由GSC表達，通過對臨床HGG標本的組織病理學評估HIF-2a，揭示了GSC在血管和缺氧或壞死區域分布。通過共定位CD133和HIF-2a陽性染色，發現在常氧條件下，HIF-2a在GSC表達。在GSC中抑制HIF-1a不影響干細胞標志物的表達，但顯著降低了神經球形成和VEGF表達，對內皮細胞增殖具有下調作用。降低GSC中HIF-2a表達能顯著減少干細胞標志物表達，相較于HIF-1a，除了能在更大程度上減少神經球形成和減少VEGF，而且其在下游對內皮細胞具有調節作用。在非GSC中，敲低HIF-2a對VEGF的生成沒有影響。有趣的是，HIF-2a在非GSC中的過表達將非GSC重編碼為GSC，強調了低氧微環境的重要性。在體內，敲低HIF能減弱腫瘤形成。

　　總之，缺氧微環境是一種獨特的微環境，通過靶向GSC能下調HIF-2a，干細胞標志物表達和VEGF信號傳導所產生的下游效應。在缺氧微環境中，封鎖VEGF可以下調其中一種效應機制。因此，缺氧微環境可能被認為是一個間接靶標。因此，針對缺氧微環境的治療主要靶點是HIF家族，主要是HIF-1a和HIF-2a分子。通過干涉HIF分子對缺氧微環境的作用，從而抑制缺氧對膠質瘤發生發展的促進作用。

　　4.展望

　　GSCs亞群細胞自我更新，并對放療和化療具有抵抗性，使得其能持續存活，引起治療后復發。GSCs與周圍增生血管、缺氧周圍壞死微環境相互作用，是其維持干細胞特性、抑制分化、增強自我更新以及放化療抵抗性和致瘤性的機制。基于此，作用于GSCs的生存微環境聯合常規手術、化療和放射治療可能為減少膠質瘤復發和改善患者生存提供了一種新的有前景的治療方法。