藥物篩選新技術及其應用進展HTS／HCS／SPR／微流控

醫藥產業是事關國家未來經濟社會發展的重要戰略性產業，是世界公認的最具發展前景的國際化高技術產業之一。新藥研發帶來的新技術創新和新品種上市是推動醫藥產業發展的源動力。隨著現代科技的發展，計算機模擬設計、化學合成、生物提取、天然產物提取等領域的技術突飛猛進，使得目標化合物的獲取更加快速高效，并在此基礎上建立了以來源、結構、作用等不同特點進行分類的各種化合物庫，化合物庫的樣品數量從幾百到上百萬不等^[1－2］。如美國 ChemDiv 公司擁有全球最大的小分 子化合物庫，除了目前庫存的125 萬種化合物以外，每年以15 萬種新化合物的速度遞增。我國的化合物樣品庫儲量在2015 年將超過100萬個，具有結構多樣化、存儲專業化、管理集中化、信息系統化和質控標準化等特點。如何從海量的化合物中篩選出有藥理活性的化合物或先導化合物，是目前醫藥行 業的研究熱點之一，也是各科研院所、醫藥公司傾力投資發展的一個重要方向^［3－4］。 

藥物篩選是指對可能作為藥物使用的各種物質，包括化學合成的化合物、蛋白多肽、天然產物、 海洋產物等，應用適當的篩選方法和篩選技術，檢測其可能存在的藥理活性，為開發新藥提供實驗依 據的方法，是連接藥物從實驗室研究到臨床應用的重要紐帶，也是提高研發效率、縮短周期、減少成本、降低風險、使新藥研發能夠持續進行的關鍵^［5］。藥物篩選的歷史悠久，所采用的技術、方法也在不斷進步，新技術的應用，促進了藥物篩選的發展和進步。應用新的藥物篩選技術也成為醫藥科學研 究的重要內容^［6］。本文就近年來新發展的藥物篩選技術并結合現有的藥物篩選技術及其應用進行了簡要綜述，主要包括高通量篩選技術、高內涵篩選技術、表面等離子體共振技術及微流控芯片藥物篩選 技術。 

1  高通量篩選技術 

1.1  高通量篩選技術的發展
高通量篩選( High throughput screening，HTS) 技術，首先需要配備快速處理樣品的全自動工作站，靈敏快速的檢測儀器和強大的計算機控制系統等硬件設備，以分子水平或細胞水平的實驗方法為基礎， 以微孔板作為實驗工具載體，通過程序控制，同一時間對數以千萬的樣品進行檢測，并以相應的數據 庫系統支持整體運轉的技術體系^［7］。HTS技術大多是以光學檢測為基礎而建立的分子水平或細胞水平 的分析檢測方法，包括光吸收檢測、熒光檢測、化學發光檢測等。由于HTS 在創新先導物的發現過程中具有快速、高效、微量等特點，雖然其出現只有幾十年時間，卻已在全世界新藥研究機構、大型醫藥公司的創新藥物發現過程中廣泛應用。HTS 模型以分子水平居多，篩選的靶點包括離子通道、酶和 受體等。HTS通常以單一的篩選模型對大量樣品的活性進行評價，從中發現針對某一靶點具有活性的樣品^［8］。靶標庫和化合物庫的建立，不僅為創新藥物的發現提供了機遇，也對 HTS 效率提出了新的要 求，使HTS朝著日篩選規模越來越大，速度越來越快的方向發展。目前已形成了可日篩選10 萬樣次的 超高通量篩選技術( Ultra high throughput screening，uHTS)^［9－10］。

1.2  高通量篩選技術的應用

潘麗等^［11］建立了穩定可靠的以轉導與轉錄激活子( STAT3) 為靶標的抗腫瘤HTS模型，應用該模型 對8,248 個潛在的抗癌藥物進行篩選，抑制率在80%以上的有5 種，在500 μmol/L 藥物濃度下，化合物MDC6 的抑制率最高為92%，為后續MDC6 的抗癌研究提供了可靠的前期數據。羅睿等^［12］建立以蛋白激酶A為靶點的抗結核藥物HTS模型，利用該模型對4,000 個微生物發酵液粗提物樣品進行篩選，最終得到21 個抑制蛋白激酶A 活性的陽性樣品，陽性率為0.53%；以恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌為檢定菌，平板紙片法檢測陽性樣品的抗分枝桿菌活性，然后對HTS 篩選的陽性樣品的細胞毒性和酶活抑制特異性進行評價，最終得到8 個陽性樣品，其中有4 個陽性樣品的酶活抑制特異性、抗菌活性均較好，且細胞毒性較低，證明該篩選模型得到的陽性藥品值得進一步研究。隨著耐藥菌株的出現，抗生素的研發變得更加緊迫。應用HTS技術，能快速從人工合成化合物庫或天然產物化合物中篩選出具有潛在抗菌活性的物質。Duetz等^［13］提供的高通量發酵技術能在96 孔板中進行菌種發酵，發酵過程能與自動化的提取和掃描平臺整合。該方法能夠在較短時間內研究多達20 種不同的培養基質對微生物次級代謝產物的影響。平板霉素正是采用這種新篩選方法得到的產物^［14］。流感病毒的PA_N 蛋白高度保守，且具有核酸內切酶活性，是抗流感藥物研發的潛在靶點。張國防等^［15］采用HTS體系，從372 種化合物中篩選出3 種對流感病毒H₅N₁ 的PA_N蛋白抑制作用較好的化合物。將這3 種化合物分別與 PA _N蛋白進行分子對接模擬，結果顯示它們均可與 PA_N 蛋白活性位點的二價金屬離子和氨基酸殘基相互作用，從而為抗流感病毒藥物的發現提供了先導化合物。Canavaci 等^［16］建立了用化學發光方法檢 測β-半乳糖苷酶的HTS模型，以384 孔板為載體，篩選了NIH 化合物庫中的303 224 種化合物，得到4,394 種能對抗美洲錐蟲病的陽性樣品，隨后的毒性檢測顯示，其中有3,005 種化合物的 IC50 ＜10 μmol/L。本課題組將由Tecan公司的全自動工作站及其連續波長多功能酶標儀組成的高通量篩選系統用于自主合成的化合物，包括β₂ 受體激動劑、PDE4 抑制劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑以及自由基清除劑 的大量篩選，得到了具有潛在藥理活性的先導化合物^{［17－19］}。  

2  高內涵篩選技術 

2.1  高內涵篩選技術的發展
細胞生物學研究已成為生命科學研究領域中最為重要的部分，尤其是步入到后基因組時代，科學家不再簡單割裂地研究單個基因或單個蛋白的功能，而是開始從一個功能整體的角度考慮問題。HTS 技術單指標的篩選方法，已經不能滿足藥物發現的需要，而且也不利于對化合物活性的綜合評價。因此，以多指標多靶點為主要特點的高內涵藥物篩選( High content screening，HCS) 技術應運而生^{［20－21］}。 

HCS的儀器一般由白色連續光源、多通道濾光片( 適于常用的熒光染料) 、顯微鏡模塊和高速高分辨率 的CCD照相機進行圖像獲取，同時還可以配備細胞培養和自動加樣模塊進行長時間全自動的實驗分析。基于激光的硬件聚焦系統使得自動對焦在200 ms以內，再結合軟件聚焦，完善了對拍攝對象的快速定位和圖像獲取。除了圖像獲取部分外，圖像采集、圖像分析和數據儲存也是高內涵藥物篩選設備 的主要組成部分。 

20 世紀70 年代Talyor等^［22］最早提出高內涵概念，此后該課題組一直致力于開發定量研究細胞的新工具，1996 年，Talyor成立了 Cellomics 公司，并于1999 年研發生產了世界第一臺商用 HCS 儀器。

進入21 世紀，單克隆抗體技術、細胞的制備方法、熒光染料的開發、儀器設備的改進以及計算機的發 展，使得HCS技術作為一門生物檢測技術已經日臻完善，應用領域日趨廣泛^［23］。

相對于HTS結果單一，HCS是篩選結果多樣化的一種篩選技術手段。HCS 模型主要建立在細胞水平，通過觀察樣品對固定或動態細胞的形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝及信號轉導等多個功能 的作用，涉及的靶點包括細胞的膜受體、胞內成分、細胞器等，從多個角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。HCS 技術克服 了以往細胞研究領域的“串行”研究方法（即 細胞周期→細胞毒理→信號轉導→代謝調控 等）效率低、速度慢的弱點，在同一實驗中， 可完成各種對于細胞生理現象本質的研究。 

這不僅大大提高了研究效率，降低了研究成本，避免了大量的重復勞動，同時獲得了比之前成倍，甚至成百倍的海量數據，為各項研究提供了第一手實踐材料。圖 1 直觀比較了HTS和HCS的共同點和差異性^［24］。從實驗載體上看，HCS 與 HTS 無顯著區別，均是在微孔板( Microplate) 上進行，兩者的樣品消耗量一致，實驗操作同樣簡單可行、自動化。 

從實驗結果看，HTS 實驗結果單一，通常只獲得每個樣品孔的最終讀數。而 HCS 的實驗結果多樣化，既有樣品孔的最終讀數，還有細胞計數、細胞形態學分析、細胞空間結構分析、細胞成像等多種實驗結果。

圖1  HTS和HCS的共同點和差異性比較^［24］ 

Fig.1  The similarities and differences between HTS and HCS^［24］  

2.2  高內涵篩選技術的應用

Baniecki等^［25］將HCS用于尋找抗瘧新藥，認為使用基于圖像的 DAPI 惡性瘧原蟲生長實驗，可以 檢測到單個瘧原蟲；而使用DAPI惡性瘧原蟲生長實驗和 ［3H］標記的次黃嘌呤實驗，96 孔板上得到 的讀數結果顯示，具有活力的瘧原蟲比例為0.25%。兩種實驗手段的結果比較表明，HCS 的靈敏度及 可靠性顯著提高。Xu等^［26］針對一系列與肝毒性直接相關的細胞表面形態變化，建立了一個 HCS 檢測 方案。在檢測300 多種藥物和化合物（其中包括許多可以導致人類罕見的肝毒性藥物）時，使用該檢測 方案，檢出率達50%～60%，假陽性率非常低，僅為0～5%。Moffat 等^［27］建立了一種基于 HCS 的方法，來鑒定有絲分裂進程中所必須的基因，并針對5,000 種表達獨特的shＲNA、以1,028 個人類基因作為靶點的慢病毒載體進行篩選，篩選到約100 個( 新型) 增殖相關的候選調控元件。此外，在藥物毒性 篩選方面，采用基于熒光成像的 HCS 進行篩選，能夠從單個細胞水平觀察到細胞內部正在發生的事件，實驗結果比傳統的MTT法的靈敏度更高，信息量更大，結果更可靠，從而降低了后續的藥物開發研究失敗的風險^{［28－29］}。本實驗室建立了以核轉錄因子NFκB為靶標的NFκB－U2OS細胞質核轉染高內涵篩選模型，通過自動獲取細胞質與細胞核的熒光強度差值( MEAN，Circ Ｒing Avg Inten Diff Ch2) ，陽性組的差值比陰性組差值大8 倍以上，說明 NFκB 在藥物刺激下入核明顯。96 孔板方法評估因子 Z － factor≥0.5。這一模型適于以NFκB為靶標的高內涵藥物篩選。

3  表面等離子體共振技術

3.1  表面等離子體共振技術的發展 
表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是指當一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍在玻璃表面的薄層金屬膜上發生全反射時，若入射光的波向量與金屬膜內表面電子的振蕩頻率一致， 光線即被耦合入金屬膜引發電子共振，即表面等離子共振。由于共振的產生，會使反射光的強度在某 一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱為共振角。共振角的大小隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結合物的分子質量成正比^［30］。由此，在20 世紀90 年代發展了應用 SPR 原理檢測生物傳感芯片( Biosensor chip) 上的配體與分析物作用的新技術^{［31－33］}。在該技術中，待測生物分子被固定在生物傳感芯片上，另一種被測分子的溶液流過表面，若二者發生相互作用，會使芯片表面的折射率發生變化，從而導致共振角的改變。而通過檢測該共振角的變化，可實時監測分子間 相互作用的動力學信息。雖然SPＲ篩選通量不及HTS和HCS，但其不需任何標記，能在更接近生理溶液的環境中直接研究靶標和分析物的相互作用，使之在藥物研究中占據著重要的一席之地。隨著商品 化SPＲ生物傳感器儀器技術的逐步成熟，儀器的管路系統、進樣方式及檢測速度等也發生了巨大變化，從最初的單點單通道分析到多通道陣列式分析，在分析通量和數據質量方面有了很大改進^{［34－36］}。 近年來在藥物篩選領域得到了廣泛應用。圖2 展示了不同時期SPＲ芯片的通路變化^［34］，其中A為一對 一模式，每個位點相互獨立，任何一個樣品只能流過其中某一個通道，通道間不能互為對照。B 是Biacore 3000 型芯片格式，4 個位點用管路相連，任何一個位點可以為其它3 個位點做空白背景的對照；C是Biacore T100 型芯片格式，1-2 通道和3-4 通道直接相連，使相鄰的兩個位點間距離明顯縮短， 對照效果更好，基線更平穩；D是Biacore S51 的芯片格式，可以同時分別進4 個樣品，任一通道均可 作為對照通道。G被襯為一次動力學模式芯片，是 Bio-Rad ProteOn XPR36 的芯片格式，可以一次性 平行標記6 個配體，芯片再旋轉90°，在垂直方向平行流過6 個分析物或者6 個不同濃度梯度的同一分 析物，一次進樣可完成兩個分子間的動力學監測。 

圖2  各種SPＲ傳感器的芯片格式^［34］
Fig.2  Schematic of flow cell configurations in the SPＲ instrument^［34］

A． one－on－one approach( 一對一模式) ; B/C/D． one－on－several approach( 一對二/三模式) ，B． the chip for Biacore3000 ( Biacore 3000 型芯片格式) ，C． the chip for Biacore T100 ( Biacore T100 型芯片格式) ，D． the chip for Biacore S51( Biacore S51 的芯片格式) ; E/F． one－on－many approach( 一對多模式) ，F． the Flexchip( Flexchip的芯片格式) ; G． one－shot－kinetic( 一次動力學模式) ，the chip for Bio－Ｒad ProtenOn XPＲ36( Bio－Ｒad ProteOn XPＲ36 芯片格式)

3.2  SPＲ技術在藥物篩選中的應用
隨著SPＲ技術檢測靈敏度的提高，SPＲ的檢測對象不再局限于大分子之間的相互作用，也可以實現蛋白質－小分子、核酸－小分子之間相互作用的檢測。由于SPＲ技術能夠直接反映兩個分子間相互 作用的強弱和動力學模式，所以采用SPＲ方法可對蛋白化合物庫、小分子化合物庫等進行篩選，假陽性率大大降低^{［37－39］}。Geschwindner等^［40］采用 SPＲ 篩選以蛋白片段為靶標的小分子活性化合物，比傳統檢測方法得到更多的活性物質，且SPＲ方法的Z－factor( 為0.67) 遠高于傳統的檢測方法( 為0.37) ， 說明SPＲ篩選方法所得結果更穩定可靠。G 蛋白偶聯受體( GPCＲs) 是細胞信號傳導中的重要蛋白質， 其拓撲構象為7 次跨膜的受體，同源性較低，當膜外的配體作用于該受體時，該受體的膜內部分與 G 蛋白相互結合，激活G蛋白。大多數的細胞激素和神經遞質細胞內外的交流通過GPCＲ信號通路完成， 藥物作用于GPCＲs從而達到治療目的。迄今已發現作為治療藥物靶點的蛋白總數約500 個，而GPCＲs 靶點占其中受體的絕大多數。很多科研工作者先后進行了用 SPＲ 技術篩選 GPCＲ 配體及藥物的研 究^{［41－44］}。本課題組利用ProteOn XPＲ36 儀器，建立了分別以 DNA、ＲNA 和 POT1 蛋白、Aβ 蛋白等為 靶標的小分子藥物篩選模型，可對源源不斷新合成的化合物進行初步的活性篩選，為化合物的進一步 開發研究提供了非常有參考價值的實驗數據^{［45－50］}。 

4  微流控芯片技術 

4.1  微流控芯片技術的發展
在毛細管電泳發展的基礎上，20 世紀90 年代Manz等^［51］提出了微全分析系統，即微流控芯片( Microfluidic chip) 或芯片實驗室( Lab on a chip) ，它是將化學和生物等領域中所涉及的樣品制備、反應、 分離、檢測及細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米( 甚至更小) 的 芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能 的一種技術平臺^［52］。經過幾十年的飛速發展，微流控芯片系統的芯片制作、檢測器研制、加樣操作等 相關技術已日趨成熟并規模化，其應用范圍覆蓋了醫學、藥學、生命科學、環境科學等諸多領域，在 藥物篩選方面也得到了非常廣泛的應用^{［53－55］}。并憑借其樣品及試劑消耗少、分析速度快、效率高、操 作模式靈活多變，以及可在生理環境或接近生理環境下運行等優點，為大規模高通量藥物篩選提供了 絕佳的實驗和檢測技術平臺。微流控芯片是最有可能滿足高通量篩選要求的新興技術平臺之一^［56］。 

4.2  微流控芯片技術在藥物篩選中的應用

在微流控芯片上進行藥物篩選，可大致分為分子水平、細胞水平和整體動物水平3 大方面的藥物 篩選。在分子水平的藥物篩選中，美國 Caliper Life Sciences 公司將微流控芯片技術應用于藥物篩選領 域，開發了微流控芯片實時動力學檢測功能的 EZ Ｒeader 系列藥物篩選平臺，在不加中止試劑的情況 下檢測酶學實驗。用于實驗的底物是帶有熒光標記的多肽，底物在反應體系中酶的作用下轉變為產物，其所帶的電荷也發生相應的變化，利用底物和產物所帶電荷的不同，將二者在芯片通道中進行分離， 并分別檢測。在檢測過程中，96 或384 孔板中的反應物通過芯片底部的吸樣針被吸入芯片通道。由于 在芯片的分離通道上施加了分離電壓，帶有熒光標記的多肽底物和反應產物由于電荷的不同而被分離， 然后在檢測窗口進行檢測( 見圖3) 。在檢測每一個樣品時，可以同時看到底物和產物的信號。該系統 可用于大規模的激酶抑制劑篩選^{［57－58］}。本課題組已在 EZ Ｒeader 平臺上開展激酶抑制劑的篩選研究。 在細胞水平的藥物篩選上，微流控芯片也具有獨特優勢。它可以將細胞種植、培養、標記、刺激、加藥、梯度稀釋等操作通過微通道網絡流體控制技術 集成到一張芯片上完成，保持了細胞結構的完整 性，可全面記錄細胞對藥物刺激的各種反應。Ye 等^［59］構建了一套用于細胞水平藥物篩選研究的集成 化微流控芯片系統，芯片結構的主體部分是由8 個 金字塔形的濃度梯度生成器網絡結構圍繞一個公共的廢液池構成，網絡結構單次可產生64 種藥物作用條件，并獲得 192 種細胞生物信號。為了進一步提高藥物篩選的準確性，在體的藥物篩選越來越受到人們的重視，并且為了降低篩選成本，會優先使用 一些模式生物來篩選藥物，如秀麗隱桿線蟲、斑馬魚胚胎等。微流控芯片則成為實現整體動物水平藥 物篩選的良好平臺^{［60－63］}。本課題組^［63］在微流控芯片上建立了斑馬魚癲癇模型，研究了維生素 C 和苯 妥英鈉對斑馬魚幼魚癲癇的解救作用。此外，《分析測試學報》近期策劃的專題——— 《微流控技術在 分析檢測中的應用》，對我國微流控技術在分析檢測領域的最新研究成果進行了總結與集中報道，其中 也凸顯了微流控技術在藥物篩選中的應用優勢^{［64－65］}。 

圖 3  微流控芯片分離檢測酶產物和底物的示意圖 Fig.3  Schematic of mobility－shift assay 

5  展  望

新藥開發，有助于治療人類所面臨的各種重大疾病，提高患者的生存質量，延長壽命，而藥物篩 選則是發現新藥的關鍵環節。藥物篩選新技術的應用，能更快速有效地從龐大的化合物庫中篩選出有 藥理活性的藥物，提高新藥開發速度，降低新藥研發成本。藥物篩選新技術之間的相互融合匹配將能 更好地達到藥物篩選的目的。比如HTS技術可借鑒HCS的成像系統，將檢測對象的反應過程通過精密 數碼相機記錄下來，為藥物活性評估提供更全面的信息。HCS 的發展可更加切實地做到高內涵篩選， 

目前已發表的有關HCS論文中，60%～80%的文章只用到雙通道成像檢測細胞對藥物刺激的變化，離 多通道高內涵檢測還有一定距離^［66］。經過HTS和HCS 篩選的靶標和藥物，可以采用 SPＲ 技術進行二 次篩選，以進一步確證藥物的活性，降低藥物開發的投資風險^［67］。微流控芯片技術由于其微型化集成 化的特點，有望集成HTS、HCS以及SPＲ篩選技術于一體，既能在分子水平評估藥物活性，也能在細 胞水平監測藥物對細胞的影響，從而更加全面完整快速地對藥物進行篩選。毫無疑問，隨著科技進步 及社會發展的需要，新的藥物篩選技術會不斷出現，各種新興技術各自發展又相互融合是未來藥物篩 選技術的發展方向，這將為新藥開發提供更強有力的技術支持，從而為人類的健康帶來福音。 

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藥物篩選新技術及其應用進展.pdf

分析測試學報，第34 卷 第11 期 2015 年11 月 ，Vol.34 No.11 1324～1330