蛋白質磷酸化的蛋白磷酸激酶的純化與活性分析

　　蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基團從磷酸供體轉移到受體蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)為供體。國際生物化學聯合會根據受體氨基酸的特異性，將蛋白激酶分為以下幾類：　　①以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶;　　②以苯基為磷酸受體的磷酸轉移酶稱為蛋白酪氨酸激酶;　　③以His，Arg或Lys為受體的磷酸轉移酶稱蛋白His激酶;　　④以Cys殘基作為受體的磷酸轉移酶稱蛋白Cys激酶;　　⑤以乙酰基作為受體的磷酸轉移酶稱天冬或谷氨酰胺激酶。
前兩類酶最常見，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。利用分子生物學技術，已克隆出100多個蛋白激酶的基因。有些已通過測定其核苷酸序列而推出其相應的氨基酸序列。在很多情況下，克隆的酶基因產物氨基酸受體特異性不能被直接測定，一般是通過序列分析與已知特異性的蛋白激酶比較而得出。所有已知的絲/蘇和酪氨酸蛋白激酶都有一個共同的催化結構域(約270個氨基酸)，通過催化結構域的序列同源性比較，可將蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亞家族。蛋白絲/蘇氨酸激酶家族較酪氨酸激酶家族大。此外，還有許多有關His，Lys和Arg特異性磷酸化酶活性的報道，但這些酶未被純化，其分子結構也不清楚。　　(一)蛋白磷酸激酶的純化
蛋白激酶的純化分微量純化和大量純化兩種，前者通常應用在特殊條件下培養的細胞，后者一般應用于特殊的組織器官。微量純化的優點是克隆化的細胞株具有均一的細胞類型并處于同步的細胞周期，細胞內成分可被放射性同位素特異標記，在細胞培養時加特殊因素可研究細胞內某些感興趣的途徑。缺點是原料少，純化出的蛋白量有限。 ，通常選用惰性系統，如Pharmacia的FPLC系統。該系統的優點是具有很大的內在惰性，并具有保持大分子生物活性的特點。該系統在一個單元內含有單一的硬件，可在冷室和室溫操作。此外，可采用快速的梯度(40～45分鐘)形式和較廣適用范圍的高效凝膠和柱系統。這是因為在此條件下多數蛋白質不與樹脂結合，包括能使激酶失活的磷酸酶。然而，許多激酶盡管其表現等電點≤5.5，但在中性條件下仍可與MonoS結合，這可能是由于其磺酸基與ATP或底物分子結構有些類似。大體積抽提物可用泵直接進樣，并進行連續兩次的離子交換分離。FPLC預裝的凝膠排阻柱可在30分鐘內完成分離，較傳統凝膠快得多。但由于柱填料粒度小，上樣體積不超過200μl，樣品量不超過5～10mg，純化量較小有些性質難以鑒定，因而需多次純化。Pharmacia引入一種新的介質(Sephacryl HR)較傳統的超細膠流速快5倍，這些凝膠在很大程度上減小了凝膠過濾色譜的時間。在完成親和純化后，酶的純度可用SDS-PAGE檢測并定量測定其比活性。　　(二)蛋白磷酸激酶的活性分析　　　蛋白激酶活性分析分為兩步：　　①末端標記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP，有時用GTP)中的磷酸基團轉移到蛋白質或肽底物上;　　②將磷酸化的底物分離出并進行定量分析。　　前者通常在溶液中進行，酶和底物均在液相中。后者為了去除游離的標記核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分離或使標記底物結合于纖維素膜上。　　有時可將酶或底物固定于固相載體上，如蛋白質混合物經SDS-PAGE后轉移到硝酸纖維素膜上，然后封閉，放入含有酶和標記ATP的溶液中。或者更進一步，設計一個蛋白激酶分析系統(酶活性的原位分析)，將蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纖維素膜上，這一方法可與標準的液相分析方法達到相等的靈敏度和線性范圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定于硝酸纖維素膜上(點滴或真空抽吸)，然后將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中，底物蛋白質與剩余的膜結合位點結合，然后加入同位素標記的ATP，作用一定時間后洗去膜上未反應的ATP并終止反應，參入物經放射自顯影或液閃計數定量，與膜結合的酶和底物均具有一定的運動性，兩者反應的定量值代表磷酸化的程度。　　以酪蛋白激酶Ⅱ的活性測定方法為例：　　試劑：緩沖液A25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，100mmol/LNaCl，pH8.0　　緩沖液B25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，10%甘油　　(V/V)，1mmol/L DTT，pH8.0　　酪蛋白激酶Ⅱ底物　水解或部分脫磷酸的酪蛋白10mg/ml溶解于緩沖液A中。　　酪蛋白激酶Ⅱ反應混合物　25mmol/L Tris，pH8.5，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/L DTT，0.1μmol/L〔V-32P〕ATP(100Ci/mmol)　　操作步驟：
1.剪一適當大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格;　　2.用緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦;　　3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個點所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉移1pmol 32P的酶量)，當酶比活性在1μmol/min·mg-1時則每個點應加純酶0.5～50ng; ，待液滴消失后將膜面對含有緩沖液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼于玻璃平板上)，在濕潤環境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封于塑料袋中;　　5.在100ml緩沖液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反應混合物溶液25　　μl/cm2)，23℃作用5～30分鐘;　　6.用緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣干燥后進行放射自顯影。或切成方塊進行液閃計數定量。
該方法在應用時最常見的問題是硝酸纖維素膜過載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結合BSA的線性范圍可達50μg/cm2(相當于每斑點5μg)，而結合容量可達500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質超載，則應降低稀釋液中的BSA濃度。同時應注意不要加過量的酶，因為超過50pM單位即超過了該方法的線性范圍，并可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點的檢測。該方法用于其它蛋白激酶檢測時應適當變換測定條件。因蛋白激酶活性的斑點印跡方法與標準的液相方法在靈敏度、檢測范圍、線性等方面相當，所以可以代替后者進行常規檢測。也在天然凝膠電泳和轉移電泳后分析蛋白激酶活性的分布，可用于分析酶在不同發育階段各組織表達的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。