酶聯免疫吸附法在食品檢驗中的應用

　　摘要：酶聯免疫吸附技術（ELISA）是將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合的一種免疫分析方法，具有操作簡便、快速、有效、特異性強等特點，能批量檢測食品中的藥物殘留、病原微生物以及轉基因食品等。本文主要闡述了酶聯免疫吸附法在食品安全檢測中的應用。 
　　食品安全問題是全球關注的焦點，它直接影響人類健康和經濟發展，幾年前的蘇丹紅事件、啤酒甲醛風波、人造蜂蜜事件、乃至今年的三鹿奶粉事件都給人們敲響了食品安全的警鐘。如何快速、有效檢測食品中的毒害殘留，保證食品的安全供應是食品檢驗中的一個重點。酶聯免疫吸附技術（ELISA）是在免疫熒光和放射免疫分析技術基礎上形成的，將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合的一種免疫分析方法。該方法操作簡便、快速、有效、特異性強，能廣泛用于臨床標本、藥物殘留、轉基因食品以及病原微生物檢測等多個領域。本文主要概述了酶聯免疫吸附法在食品安全檢測中的研究及應用前景。 
　　1、酶聯免疫吸附法概述 
　　1.1 原理 
　　ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。 
　　1.2分類 
　　目前ELISA檢測方法的分類仍沒有統一的定論，在這些測定方法中都有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。ELISA的主要類型包括雙抗體夾心法、間接法、捕獲包被法，以及競爭法。其中捕獲包被法主要用于測定IgM類抗體；雙抗體夾心法和間接法主要用于測定抗體和大分子抗原，適用于臨床診斷；而競爭法測定的是小分子抗原，適于食品分析[1]。 
　　2、酶聯免疫吸附法在食品檢測中的應用 
　　2.1食品中微生物的檢測 
　　微生物檢測是評價食品被污染程度的重要指標，一般來說微生物檢測分為常規菌檢測和致病菌檢測。傳統檢測常規菌的方法是富集培養后計數，對于致病菌檢測不僅需要分離培養，還需要進行生化反應鑒定，檢測周期長且不易檢出潛在的致病菌。比如某些細菌，大腸桿菌、霍亂弧菌等在低溫貧營養條件下，可進入“活的非可培養狀態”（VBNC），在適當條件下又可以復蘇，仍具有致病力。姚斐等[2]用間接ELISA可快速有效檢測出VBNC大腸桿菌O157：H7，此外，采用Dot-ELISA檢測沙門氏菌，耗時短，比傳統方法快4-6d，這都表明了ELISA在這方面有一定的潛力 
　　2.2食品中藥物殘留的檢測 
　　食品中的藥物殘留主要包括農藥、獸藥的殘留以及各種飼料添加劑的殘留等，傳統的檢測方法有氣象色譜、質譜以及高效液相色譜等，但這些方法檢測痕量藥物時成本高、對儀器要求也較高。而ELISA法檢測操作簡單、靈敏，可同時檢測大批量樣品，目前已有商業化的ELISA試劑盒可供選擇，使得ELISA檢測成為普通實驗室的常規技術。余向陽等[3]以辣根過氧化物酶對兔抗擬除蟲菊酯類農藥抗體進行標記，建立了檢測蔬菜中多種擬除蟲菊酯類農藥的直接競爭抑制ELISA方法，用該方法對南京市場107個樣品檢測的陽性檢出率明顯高于氣相色譜法。Li[4]報道了用間接競爭ELISA法檢測殺蟲劑吡蟲啉，其最低檢出量為30ng/mL。岳秀英等[5]建立了酶聯免疫吸附法檢測牛奶中殘留的青霉素，最低檢出限為2.0μg/L，達到了國內外行業標準規定的要求。賀亮[6]研究了磺胺二甲嘧啶殘留檢測ELISA反應的各種條件并進行了篩選優化，建立了直接競爭ELISA檢測方法，該法最小檢出量為1.97ng/mL，檢測范圍5ng/mL～200ng/mL。現已開發的商業化酶聯免疫ELISA檢測試劑盒，可快速定性、定量檢測動物組織（肌肉/肝臟/魚/蝦）、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。 
　　三聚氰胺[C3N3（NH2）3]，俗稱“蛋白精”，是一種有機化工原料，常溫下為一種無毒無味的白色結晶粉末，添加到飼料中可以冒充蛋白質，少量添加即可大大提高蛋白含量。在飼料中添加三聚氰胺是屬于違規行為。陳錫龍等[7]用市售的美國Beacon Analytical Systems Inc.公司開發的三聚氰胺定量檢測試劑盒對檢測動物飼料樣品進行了初步的研究和探討，結果表明，該試劑盒可以用來進行三聚氰胺檢測的篩選，從而節約時間、減少工作量、降低檢測成本。 
　　2.3食品中毒素的檢測 
　　食品中天然存在的毒素、適合條件下產生的次生代謝毒素，以及在加工過程產生的毒素，如動物肝臟毒素、河豚毒素、真菌毒素、亞硝基胺等都會對引起食物中毒，甚至對人體造成畸形、癌變等危害，所以食品中毒素也日益受到關注。黃曲霉毒素是一種致毒性和致癌性很強的真菌毒素，各國都嚴格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最強。1977年，La Well首次采用了ELISA法來檢測黃曲霉毒素。蔣建云等[8]利用ELISA法的AFB1試劑盒，通過抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標抗原、待測抗原的競爭免疫反應以及酶的催化顯色反應相結合來檢測黃曲霉毒素B1的含量。具有分析速度快，提取和純化步驟簡便，準確度高、成本低、污染少，一次可測定大批量等優點。Ying等[9]將化學發光反應作為終止反應引入直接競爭ELISA法中發展的ECL-ELISA體系，可檢測黃曲霉毒素B1的范圍是0.14-0.9μg/L，最低檢出限為0.09μg/L，比使用相同抗體和辣根過氧氫酶結合物的常規ELISA檢測的靈敏度高了10倍而時間減短了30%，這表明ECL-ELISA法能夠用于食品中FB1的特異性檢測和常規檢測。 　　2.4轉基因食品的檢測 
　　轉基因食品就是利用現代分子生物技術，將某些生物的基因轉移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質而創造的新產品。直到目前為止，對于轉基因食品安全性評估仍沒有共識，許多國家都有嚴格的法規來管理轉基因食品。我國在1993年由國家科委頒布了“基因工程安全管理辦法”，用于指導全國的基因工程研究和開發工作。2000年又由國家環保總局牽頭，8個相關部門參與，共同制訂了《中國國家生物安全框架》。轉基因生物的檢測技術大體可分為兩種：一是從插入基因入手的PCR法，二是檢測表達蛋白的ELISA法。美國FDA已研究出用雙夾心ELISA法檢測食品中是否含有轉基因玉米成分，EnviroLogix ELISA試劑盒可用于測定玉米中的CrygC蛋白，在同一實驗室和實驗室間共測定了9種含玉米的食品，測定結果的重現性很好。顧煒煒、潘家榮[10]研制了用于檢測轉基因食品中Btcry2Ab/2Ac殺蟲蛋白的直接競爭ELISA試劑盒，研究結果表明：該試劑盒的最低檢測限為40ng/mL，線性檢測范圍為40～2000ng/mL，可滿足實際生產中大批量樣品的快速檢測。 
　　2.5食品中其他成分的檢測 
　　牛乳是日常生活中不可或缺的營養品，為人體提供了豐富的營養成分。牛乳特別是牛初乳中IgG的含量很高，其含量與其他生物活性物質的含量具有一定的正相關，測定IgG的含量足可以說明產品的優劣。常規方法無法檢測IgG的含量和活性，酶聯免疫吸附試驗可以解決這個問題，Hurley等[11]用間接競爭ELISA法最低可檢出1.0μg/mL的牛IgG或是0.1% （V/V） 的牛奶摻雜物。 
　　在肉制品中摻假不僅損害消費者的利益，還有可能引起某些人對某種肉的過敏反應，因此必須建立鑒別肉的組成的方法。ELISA方法快速、靈敏，并已在商業上得到應用，對生鮮肉通常是檢測血清白蛋白，對熱處理的肉制品則需檢測對熱穩定的肌肉抗原。陸朱發等[12]以辣根過氧化物酶標記兔抗不同動物肌肉和血清球蛋白抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉，檢出率均在95%以上。與其他血清學方法相比具有較高的敏感性和特異性，判斷指標客觀真實。Rencova建立了間接競爭ELISA來檢測經熱處理的雞肉、馬肉、袋鼠肉和鼠肉，用該法對市購的62種肉制品進行檢測，發現標明只含有牛肉或豬肉的產品中有4個含有雞肉，鼠肉未檢測到[13]。Y. AYAZ等[14]用酶聯免疫分析試劑盒對100種肉制品進行分析，結果發現22%的抽樣樣本都存在不同程度的摻假現象。 
　　3、結語 
　　與傳統的檢測方法相比，ELISA分析法具有特異性高、靈敏度高、穩定性好、操作簡單、可大批量檢測樣品、對儀器要求不高等特點，可降低檢測的成本從而實現樣品的現場檢測。但是ELISA法也有一定的局限性：（1）制備抗體比較困難；（2）對試劑的選擇性高，無法進行多殘留檢測；（3）分析低分子量或不穩定的化合物有一定的困難；（4）對結構類似的化合物存在一定程度的交叉反應；（5）易出現假陰性結果：一方面蛋白質在食品加工過程中易變性，已加工食品中的蛋白質很可能失去抗體所針對的抗原表位，從而造成ELISA檢測結果假陰性。另一方面蛋白質在受體生物基因組內表達前后如進行新的修飾，也可導致檢測敏感性降低及假陰性結果。 
　　隨著科技的進步和研究的深入，不斷開發重復性好的單克隆抗體和高免疫原性的重組抗原，增加ELISA檢測的特異性、擴大檢測的范圍、提高檢測的穩定性，加快ELISA的商業化進程。此外，將ELISA檢測同其他檢測技術（如PCR、HPLC、GC/MS）相結合，實現強強聯合，增加檢測的靈敏度、降低交叉反應，使ELISA檢測更加準確的定量。在未來的食品安全檢測中，ELISA檢測將會發揮越來越重要的作用。