鐵蛋白免疫電鏡技術原理和操作步驟

實驗概要

本文介紹了鐵蛋白免疫電鏡技術的原理、材料試劑和操作方法等。

實驗原理

免疫鐵蛋白技術是以鐵蛋白標記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。

主要試劑

1．馬脾鐵蛋白

2．硫酸銨

3．硫酸鎘

4．雙異氰酸鎘二甲苯(Metaxylene dlisocyante ，XC)以0.30mol/L pH9.5硼酸鹽緩沖液將XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必須特別清潔，配制后放置4℃數天，以不出現沉淀為準。如出現沉淀XC的多聚體形成，應重配。

5．0.30Mol/L pH 9.5硼鹽酸緩沖液

6．0.1Mol/L硫酸銨液

7．0.05Mol/L pH7.4 PBS液

實驗步驟

1．鐵蛋白的提取

   1) 配制2%硫酸銨液，并以1mol/L的NaOH或HCl調pH值，正好為5.85。取1g鐵蛋白溶于100ml的2%硫酸銨液中。

   2) 加入20%硫酸鎘，使最終濃度為5%，混勻，4℃過夜。

   3) 1500g離心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸銨至100ml，混勻，離心，去除不純沉渣。

   4) 于上清液中重新加入20%硫酸鎘，重復步驟⑵，離心，去上清。

   5) 檢查沉渣，置顯微鏡下檢查，應具有典型的黃褐色結晶，結晶為六角形，雙一四點結構，如結晶不典型，應繼續重復以上步驟。

   6) 以少量的蒸餾水溶解，再加50%飽和硫酸銨溶液，使之沉淀，離心，去上清。

   7) 重復步驟⑹一次。

   8) 以少量蒸餾水溶解,常水透析24h后，以0.05mol/L pH7.5 PBS透析24h。

   9) 100000r/min離心2h，去除上部無色上清液(約3/4總量)，置4℃過夜。

   10) 用微孔濾膜(孔徑0.45μm)過濾，使鐵蛋白含量為65mg/ml-75mg/ml，分裝，4℃保存不要凍干保存,以免鐵蛋白結構遭破壞。

2．鐵蛋白－抗體交聯法

   1) 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將鐵蛋白稀釋成20mg/ml-25mg/ml。

   2) 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室溫攪拌45min，離心去沉淀。

   3) 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將提純lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白－XC液，4℃攪拌48h。

   4) 以0.1Mol/L碳酸銨溶液透析過夜，以除去多余的異氰酸鹽，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢復到生理水平。

   5) 超速離心以1.00×105g離心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS懸浮，再次離心，以除去未結合的IgG。

   6) 以血清學及免疫學方法測定結合抗體的特異性、免疫活性以及標記效應，如果操作步驟嚴格，結果是滿意的。

3．鐵蛋白－抗體結合物處理標本

   1) 將標本以5%福爾馬林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min-60min。

   2) 用冷的PBS液洗滌，離心。

   3) 如是組織塊，則在解剖顯微鏡下切成更小塊，放入試管中，加入鐵蛋白－抗體結合物置室溫20min，不時振蕩,

   4) 以冷PBS液洗滌三次，離心。

   5) 沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗滌。

   6) 再以鋨酸固定，脫水包埋。

也可以先超薄切片，再進行鐵蛋白－抗體結合物染色。

操作如下：

   1) 將培養細胞以1%福爾馬林PBS液固定(4℃)。

   2) PBS液洗滌離心。

   3) 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中，再將袋置于吸水劑粉末上，待牛血清白蛋白成膠狀物時，將透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。

   4) 取出，切成小塊，以PBS液洗滌。

   5) 置干燥器中以硅膠干燥。

   6) 包埋、切片、在水上收集切片置于經4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網上(牛血清白蛋白的處理在于減少鐵蛋白結合物非特異性吸附于載網上)。

   7) 滴一滴鐵蛋白－抗體結合物于載網上。

   8) 5min后，浮網于PBS液面,標本面向下，以除去多余的結合物。

   9) 涼干后，滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復染。

   10) 水洗、晾干、電鏡觀察。

4. 結果判定

在已知對照樣品成立的前提下，凡是出現黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性(＋)，否則判為陰性(－)。