試劑、試劑盒 EDTA礦物油TN 緩沖液PCR 緩沖液聚合酶混合液XmaⅠXmaⅠ緩沖液DNAdNTP 溶液各稀釋的第二次雜交樣品PCR 引物
儀器、耗材 熱循環儀水浴箱瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備酚
實驗步驟
第 1 階段：用于 MOS 和 XmaⅠ消化的 PCR 擴增
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
EDTA,0.2mol/L
礦物油
TN 緩沖液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)
2. 酶和酶緩沖液
PCR 緩沖液，10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸鎂，10mmol/L 乙酸鉀，75 mg/mlBSA，或者廠商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相當產品）
XmaⅠ(10U/ul)
XmaⅠ緩沖液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
DNA
dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)
各稀釋的第二次雜交樣品（來自方案 2 第 17 步）
PCR 引物 P1
PCR 引物 NP2R
PCR 引物 P1
4. 專用設備
熱循環儀
水浴，預設為 37°C 和 74°C
5. 附加試劑
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的試劑
二、方法
1. 用于 MOS 的初級 PCR 擴增
(1) 從每個稀釋的第二次雜交產物中（來自方案 2 第 17 步）各取 10ul，加到標記好的管子中。
(2) 按照下表，配制用于初級 PCR-1 的主體混合液。這個配方足夠做一個反應。根據要按比例擴大。對于每個反應，按照下表將試劑混合。
(3) 混勻，并短暫離心。
(4) 將 115ul 主體混合液分裝到第 1 步的反應管中。
(5) 將最終的 125ul 混合液，分裝到 5 個 0.5 ml(原文為 ul—譯者改）的 PCR 管中(每管 25ul)。
(6) 用 1 滴礦物油覆蓋。
(7) 將反應混合液在熱循環儀中 74°C 溫育 5 min，以延伸接頭，然后立即開始以下循環。
(8) 從 5 個初級 PCR-1 產物中，各取 2ul 到一個管中混合，并加 390ulH20。
(9) 從第 8 步稀釋的每個初級 PCR-1 產物混合液中，各取 1ul 到一個標記妤的 PC 管中。
(10) 按照下表，配制用于初級 PCR-2 的主體混合液。
(11) 混勻，并短暫離心。
(12) 將 24ul 主體混合液分裝到第 9 步的各反應管中。
(13) 用 1 滴礦物油覆蓋。
(14) 立即開始以下循環。
(15) 從每個反應產物中，各取 4ul 在 2.0% 瓊脂糖凝膠上分析。
2. 用于 MOS 的次級 PCR
(16) 從上面第 14 步產生的每個初級 PCR-2 混合液中，各取 2ul, 用 38ulH20 稀釋。
(17) 從每個稀釋的初級 PCR-2 產物混合液中，各取 2ul，分裝到標記好的管子中。
(18) 按照下表，配制用于次級 PCR 的主體混合液。這個配方足夠做一個反應，根據需要按比例擴大。對于每個反應，按照下表將試劑混合。
(19) 混勻，并短暫離心。
(20) 將 48ul 主體混合液分裝到第 2 步的反應管中。
(21) 用 1 滴礦物油覆蓋。
(22) 立即開始進行 10~12 個循環：95°C 10s，68°C10s,72°C1.5 mm。
(23) 從每個反應產物中各取 4ul 在 2.0% 瓊脂糖凝膠上分析。
(24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀純化次級 PCR 產物。
(25) 用 20~40ulTN 緩沖液溶解沉淀，使 DNA 濃度為 20ng/ul
(26) 取 2ul 純化的 PCR 產物，在 2.0% 瓊脂糖/溴化乙錠凝膠上分析。
(27) 用 1.6 mlH20 稀釋 14 第 10 步純化的 PCR 產物（這將作為未消化的對照）。
(28) 反應產物保存在-20°C。
3.XmaI 消化
(29) 在管中加入下列試劑
(30) 混勻，然后在 37°C 溫育 2 h。
(31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA，以終止反應。
(32)74°C 溫育 5 min, 使酶失活。
(33)-20°C 保存。
第 2 階段：MOS 雜交
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
稀釋緩沖液（20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)
4X 雜交緩沖儲存液：4mol/LNaCl，200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷
基三乙基溴化銨（CTAB)，最終的 1X 雜交混合液用稀釋緩沖液來稀釋礦物油
2. 核酸和寡核苷酸
XmaI 消化的 DNA
3. 專用設備
熱循環儀
二、方法
1. 在一個 1.5 ml 的離心管中，混合以下試劑。
2. 從混合液中，取 2ul 到一個 0.5 ml 的離心管中，用 1 滴礦物油覆蓋。
3. 在熱循環儀中 98°C 溫育 1.5 min。
4. 在熱循環儀中 68°C 溫育 3 h。
5. 在管中加 200ul 稀釋緩沖液，并吹吸混勻。
6. 在熱循環儀中 70°C 加熱 7 min。
7.-20°C 保存。
第 3 階段：MOSPCR 擴增
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP, 每種為 lOmmol/L)
礦物油
2. 酶和酶緩沖液
PCR 緩沖液，lOX（4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2，3.5 mmol/L 乙酸鎂，10 mmol/L 乙酸鉀，75 mg/mlBSA, 或者廠商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech, 或相當產品）
3. 核酸和寡核苷酸
稀釋的 DNA 樣品（雜交后的樣品及相應的未消化對照，方案 4 第 2 階段第 6 步和方案 4 第 1 階段第 26 步）
MOSPCR 引物（NP2Rs)
4. 專用設備
熱循環儀
5. 附加試劑
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備
二、方法
1.按照下表，為所有的 MOSPCR 配制主體混合液。
2.在標記好的含有 24ul 主體混合液的管子中，各加 lul 稀釋的 DNA 樣品（雜交后樣品及相應的未消化對照）。
3.用 1 滴礦物油覆蓋。
4.將反應混合液放在熱循環儀中，74°C 溫育 5 min, 以延伸接頭（不要將樣品從熱循環儀中取出）。
5.立即開始下面的循環。
6.從每個管中，各取 4ul 在瓊脂糖凝膠上分析。
7.反應產物保存在-20°C。
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