長期培養檢測法檢測造血干細胞（LTCIC）

實驗概要

長期培養檢測法檢測造血干細胞（LTC-IC）

主要試劑

DPBS，HSCs培養液，MethoCult?培養基，HSCs稀釋液、細胞基礎培養液、HLTM液體

主要設備

離心機，超凈臺，體視鏡，倒置顯微鏡鏡，96孔培養板、100 mm培養皿，3mL注射器，16號鈍針頭，移液器，渦旋儀，5 mL、10mL移液管，離心管

實驗材料

M2-10B4成纖維細胞系（ATCC，CRL1942）

實驗步驟

（1）制備飼養層細胞
（2.）HLTM液體分裝
（3）接種被檢測細胞
（4）細胞接種5～6周之后進行檢測，每周半量換液。
（5）收集細胞進行檢測。棄上清，加0.25%Tripsin進行消化，要求消化過程中在鏡下觀察，根據造血細胞和飼養層細胞消化時間不一樣的原理，待飼養層還沒有消化下來，造血細胞已經消化合適時用胰蛋白酶消化終止液終止消化。
（6）下面步驟同CFU檢測方法（3）-（11）。
(3)準備三個35 mm的培養皿，制備雙份培養系統。具體方法如下：把兩個35mm的帶蓋培養皿和一個盛有水的35mm無蓋培養皿一起放置到100 mm的培養皿中。
(4)準備CD34 細胞，細胞計數儀計數后用0.3mlIMDM 2%FBS稀釋細胞至10倍的接種終濃度。推薦細胞數是每個3.5 cm培養皿500～2000個細胞。然后把稀釋后的細胞懸液按照1：10的比例加到MethoCult?培養基中
 (5)將細胞轉移到裝有MethoCult?培養基的流式管后立刻劇烈渦懸振蕩。然后靜置5 min，使氣泡消散。
(6)將無菌的16號鈍端針頭接到無菌的3mL注射器上，用注射器吸取MethoCult?培養基和細胞的混合物，每個3.5 cm培養皿中加入1.1mL，蓋好蓋子。每接種一支試管的混合物，用一套新的鈍端針頭和注射器。
(7)重復（5）-（6）中操作，將細胞接種到另外一個35 mm培養皿中。
(8)輕輕傾斜并旋轉培養皿，使培養液在培養皿內鋪滿，并分布均勻。
(9)將接種好細胞的35 mm培養皿置于10 cm培養皿中，并在不蓋蓋子的35 mm培養皿中加入3 mL無菌水，把10 cm培養皿的蓋子蓋好。
(10)將培養皿置于CO₂培養箱中，培養14～16天。
(11)經過14～16天的培養后，進行克隆計數。
在培養的不同時期取1×10⁵個細胞進行CFU培養，隨培養天數增加，CFU形成數量和種類都有所下降。