隨機引物法

大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段模板 DNA

醋酸氨牛血清白蛋白乙醇溴化乙啶NA 終止 貯存緩沖液隨機引物緩沖液

堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠沸水浴Sephadex G-50 離心柱

一、材料

1. 緩沖液和溶液

醋酸氨（10 mol/L)

牛血清白蛋白（10 mg/ml)

乙醇

溴化乙啶（10 mg/ml）或 SYBR Gold 染液

NA 終止/貯存緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.5% (m/V) SDS）

5X 隨機引物緩沖液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，20 mmol/L DTT，未標記的 dNTP 各 2 mmol/L，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 調至pH 6.6），1 mg/ml 長度為 6 個堿基的隨機脫氧寡核苷酸引物）

2. 酶和緩沖液

大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝膠

堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠

4. 核酸和寡核苷酸

長度為 6 或 7 個堿基的隨機脫氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6 )

模板 DNA

5. 放射性復合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）

6. 專用設備

沸水浴

Sephadex G-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 電泳后用溴化乙錠（終濃度 0.5 μg/ml）或 SYBR Gold 染膠，切下所需條帶，盡可能切去多余的凝膠。

2. 將切下的條帶放入預先稱過重量的微量離心管中，稱出帶的重量。每克瓊脂糖凝膠加水 3 ml。

3. 將微量離心管放在沸水浴中煮 7 min 以使凝膠融化，同時也使 DNA 變性。

如立即進行標記，可將離心管置于 37℃，直至需要加入模板；否則可貯存于 -20℃。但每次從 -20℃ 取出后，含 DNA 的凝膠團要在 100℃ 加熱 3~5 min，然后置于 37℃ 直至放射性標記反應開始。

4. 將一個新的微量離心管置于 37℃ 水浴或加熱板上，按下列次序加入：

5X 寡核苷酸標記緩沖液            10 μl

10 mg/ml 牛血清白蛋白溶液      2 μl

DNA ( 體積不超過 32 μl）         20~50 ng

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP           5 μl

( 比活性 >3000 Ci/mmol）

Klenow 片段（5 單位）            1 μl

水                                           加至 50 μl

用微量加樣器徹底混合各組分，于室溫溫育 2~3 h 或 37℃ 溫育 60 min。

5. 在反應液中加入 10 μl NA 終止/貯存緩沖液，可根據需要進行以下步驟。

貯存放射性標記的探針于 -20℃ 以備雜交用。

或

通過離心柱層析分離放射性標記的探針與未結合的 dNTP 或以乙酸銨和乙醇選擇性地沉淀放射性標記的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反應中摻入，可不進行該步驟。