非肌肉肌動蛋白的純化
| 實驗材料 | 非肌肉肌動蛋白 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | DNA 酶Ⅰ緩沖液 |
| 儀器、耗材 | DEAE 柱 |
| 實驗步驟 | 1. 準備貯存液和材料。 2x DNA 酶Ⅰ緩沖液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 1 mmol/L DTT 0.4 mmol/L CaCI2 0.4 mmol/L ATP 抑蛋白酶肽 抑蛋白酶 亮抑蛋白酶肽 抑胃酶肽 A PMSF TPCK 50% 甲醛在 DNA 酶柱緩沖液中 0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中 0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ緩沖液中 DNA酶Ⅰ柱緩沖液 2. 準備一個 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的親和柱。 3. 準備一個 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ緩沖液平衡的 DEAE-纖維素。 4. 通過離心收集細胞并用等滲鹽溶液（例如 PBS ) 洗去培養液。 5. 在加蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液中重懸細胞沉淀物。 6. 用對于感興趣細胞的標準方法進行細胞勻漿。 7. 用相差顯微鏡證實超過 99% 的細胞已經裂解了。 8. 100000 g 離心裂解物 45 分鐘。 9. 用巴斯德吸管轉移上清，避免混入脂肪。 10. 柱子上樣： (1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ緩沖液加蛋白酶抑制劑平衡了的 DNA 酶Ⅰ親和介質混合，并把介質/蛋白混合物倒到一個小桿子中。 (2) 在裝填柱子時收集流出液，通過用抗肌動蛋白抗體進行的免疫印跡、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 來證實有大量肌動蛋白留在柱子中。 11. 用 2 倍體積含蛋白酶抑制劑的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制劑和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱緩沖液洗柱子。 12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫肌動蛋白。 13. 立即把 50% 甲醛洗脫液上樣到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。 14. 用 5 倍體積的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱緩沖液洗脫。分部收集，每管 200 μl。 15. 檢測收集液的蛋白濃度，然后混合出峰時的收集液。 16. 加 MgCl2 使濃度為 2 mmol/L ( 這是選用于天然肌動蛋白），以使肌動蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽組成。 產量應該是 5% 左右，所以從濕重 10 g 的細胞指望得到 2.5~5 mg 純化了的肌動蛋白是合理的。 |
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