食品中常用防腐劑（抗氧化劑、保鮮劑）完全篩選方法

　　常用的食品防腐劑有苯甲酸類、山梨酸類、對羥基苯甲酸酯類、丙酸鈣(鈉)、乳酸鈣(鈉)、雙乙酸鈉、脫氫乙酸等。

　　具有防腐作用但目前不作為食品添加劑使用、易被濫用的防腐劑有水楊酸、對羥基苯甲酸、間羥基苯甲酸等。

　　保鮮及抗氧化劑有丁羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)和特丁基對苯二酚的測定(TBHQ)、對叔丁基苯酚、2-苯基苯酚、2-萘酚、4-苯基苯酚等。

　　食品防腐劑主要通過三種途徑起到防腐作用：1.抑制微生物細胞壁的形成;2.影響細胞膜的功能;3.抑制蛋白質的合成或使蛋白質變性。

　　每一種防腐劑，主要以一種途徑對微生物產生作用，因此，單一使用一個防腐劑，“抗菌譜”會比較小，并且往往需要比較大的濃度，容易超標。

　　許多食品、特別是營養豐富的食品，會常常聯合使用多種防腐劑，以擴大“抗菌譜”，降低單個防腐劑的濃度，提升防腐效果，延長食品保存時間。例如苯甲酸類和三梨酸類防腐劑經常會聯合使用，提高防腐效果。

　　現行的國標方法有一些是同時檢測多種防腐劑的，如《國家食品安全標準 GB 21073-2010乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定》等，非常合理地結合食品行業的特點制定相應的檢測方法。

　　但還有一些標準，只是單一的檢測某一種防腐劑，而對一些超出使用范圍的“合法的”防腐劑沒有做相應的檢測規定，容易造成“符合標準的不安全產品”的產生;而對于一些非法的防腐劑，目前還缺少相應的檢測方法。

　　針對這種現象，結合防腐劑的物理化學性質，我們研究出一套解決方案，力求用簡單的步驟，一次性分析盡可能多的防腐劑。

　　首先我們把防腐劑分成兩大類：水溶性的和脂溶性的。水溶性的防腐劑主要有苯甲酸類、羥基苯甲酸類(非法防腐劑)、山梨酸類、小分子有機酸類等(乳酸、丙酸、雙乙酸)，這些防腐劑只要用于水溶性或水溶性為主的食品中，如飲品、糕點、調味料等。

　　脂溶性防腐劑(保鮮劑)主要有羥基苯甲酸酯類、丁羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)和特丁基對苯二酚(TBHQ)、對叔丁基苯酚、2-苯基苯酚、2-萘酚、4-苯基苯酚等，這些添加劑主要用在含油較多食品或干果等食品中。

　　防腐劑(保鮮劑)只有在充分溶解或均一分布在食品介質中，才能發揮防腐保鮮效果，因此，根據食品基質狀況，大致可以判斷可能含有哪一類防腐劑(保鮮劑)，選用合適的提取純化方法，進行測定。

　　此方案的特點是：無論是防腐劑(保鮮劑)是水溶性的還是脂溶性的，都是采用同一種凈化小柱和同一根HPLC色譜柱，具有非常廣泛的適用性，方便使。

　　1 實驗部分

　　1.1 儀器與試劑

　　HPLC色譜儀1(Agilent 1200)

　　HPLC色譜儀2(HITACHI L2000)

　　SPE減壓裝置(Phenomenex)

　　SPE凈化小柱：Strata-X-A 200mg/3mL(P/N 8B-S123-FBJ)

　　如樣品量大，或富含有機酸的樣本，選用 Strata-X-A 500mg/3mL(P/N 8B-S123-HBJ)

　　HPLC色譜柱：Synergi Polar-RP 4μ 250×4.6mm (P/N 00G-4336-E0)

　　水溶性防腐劑方案：

　　提取：

　　1、 水溶液樣品：精密取樣品10mL,加0.1g碳酸氫鈉，充分溶解，含CO2樣品超聲除去，用pH試紙檢測溶液pH為7左右(如pH<7,繼續添加碳酸鈉調pH至7)，0.45μm濾膜濾過，續濾液作為待凈化溶液。

　　2、 半固體樣品和固體樣品：精密取樣品1～5g,加0.1M的碳酸氫鈉溶液10～20mL，超聲溶解，溶液0.45μm濾膜濾過，續濾液作為待凈化溶液。

　　凈化：

　　SPE小柱：Strata-X-A 200mg/3mL(P/N 8B-S123-FBJ)

　　活化平衡：3mL甲醇，3mL 0.1M 碳酸氫鈉(pH 7)

　　上樣：2～5mL待凈化液

　　清洗1：水 3mL

　　清洗2：甲醇 3mL

　　吹干1min

　　洗脫：2mL×2 0.1% HCL 甲醇

　　合并洗脫液至5mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，0.45um濾膜過濾，續濾液作為待測溶液。

　　HPLC測定：

　　儀器：Agilent 1200 四元低壓梯度泵，紫外-可見檢測器

　　色譜柱：Synergi Polar-RP 4μ 250×4.6mm (P/N 00G-4336-E0)

　　保護柱：KJ0-4282 AJ0-6076

　　檢測波長：0～9min,200nm;9.1～11min,270nm;11.1～25min,230nm。

　　進樣體積：5μL

　　標準品濃度：乳酸、乙酸、丙酸1.0mg/ml，對羥基苯甲酸、3-羥基苯甲酸、山梨酸、苯甲酸、水楊酸、富馬酸、沒食子酸0.1mg/ml，溶劑為水。(紅色字體物質注為非法添加劑)。

　　流動相及梯度程序：

時間	20mM磷酸二氫鉀（pH2.5）	乙腈
0	100	0
5	100	0
5.1	72	28
22	72	28
22.1	100	0
25	100	0

　　乳酸(乳酸鈣)、乙酸(雙乙酸鈉)、丙酸鈉放大圖譜(200nm)

　　脂溶性防腐劑(保鮮劑)方案：

　　提取：精密取樣品1～5g,加0.1M的氫氧化鈉溶液10～20mL，超聲溶解，溶液0.45μm濾膜濾過，續濾液作為待凈化溶液。

　　凈化：

　　SPE小柱：Strata-X-A 20mg/3mL(P/N 8B-S123-FBJ)

　　活化平衡：3mL甲醇，3mL 氫氧化鈉溶液

　　上樣：2～5mL待凈化液

　　清洗1：0.1M 氫氧化鈉溶液 3mL

　　清洗2：0.1M氫氧化鈉溶液甲醇溶液 3mL

　　吹干1min

　　洗脫：2mL×2 0.1% HCl甲醇

　　合并洗脫液至2mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，0.45um濾膜過濾，續濾液作為待測溶液。

　　HPLC測定：

　　儀器：HITACHI L2000 四元梯度泵，L2300紫外-可見檢測器

　　色譜柱：Synergi Polar-RP 4μ 250×4.6mm (P/N 00G-4336-E0)

　　保護柱：KJ0-4282 AJ0-6076

　　檢測波長：280nm

　　進樣體積：10μL

　　標準品濃度：0.1mg/mL 溶劑為甲醇

　　流動相及梯度程序：

時間（min）	乙腈	水
0	40	60
2	40	60
22	47	53
23	95	5
35	95	5

12種脂溶性防腐劑標準品圖譜

加標回收率：

 

10種水溶性防腐劑

12種脂溶性防腐劑、抗氧化劑

名稱  回收率  RSD n=5

乳酸  83.3%   4.3%

 

防腐劑、抗氧化劑分析啟動包

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