食品中肉毒桿菌的檢驗方法淺析

肉毒桿菌是一種生長在缺氧環境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封腌漬食物中具有極強的生存能力。它在繁殖過程中所分泌的毒素具有極強的毒性，是氰化鉀毒性的一萬倍，是毒性最強的毒素之一。純化結晶的肉毒桿菌毒素 1 mg 能殺死 2 億只小鼠，對人的半致死量為 40 IU/kg。

肉毒桿菌毒素(Botulinum Toxin)前體是在肉毒桿菌細胞內產生的無毒化合物，肉毒桿菌死亡后無毒化合物釋放出來，經腸道中的胰蛋白酶或細菌產生的蛋白酶激活后方始具有毒性。 肉毒桿菌毒素作用的機理是阻斷神經末梢分泌能使肌肉收縮的乙酰膽堿，從而達到麻痹肌肉的效果。人們食入和吸收這種毒素后，神經系統將遭到破壞，將會出現頭暈、呼吸困難和肌肉乏力等癥狀。

新西蘭乳制品巨頭恒天然集團8月3日宣布，旗下部分嬰兒奶粉和運動飲料等產品可能 “受到污染”，含有肉毒桿菌。多家食品廠商產品受到影響。RephiLe 技術人員根據《GB/T4789.12-2003食品中衛生微生物學檢驗肉毒桿菌及內毒素檢驗》和《SN/T 2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR 檢測》總結出了對食品中肉毒桿菌進行初步檢驗的方法。

一、實驗原理

將樣品經增菌后劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯 (TPGY)培養基培養，對培養物用 DNA 提取試劑盒抽提 DNA，進行 PCR 擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗 PCR 產物中是否含有肉毒桿菌的的特征條帶，從而初步判斷食品是否被肉毒桿菌污染。

二、儀器和試劑

紫外檢測儀 NanoDrop1000 (Eppendorf)，臺式微量冷凍離心機 Microfuge 22R(Beckman Counter)，凝膠成像分析系統 Gel DocTM XR (Bio-RAD)， PCR儀 My Cycler (Bio-RAD)，Direct-Pure UP 超純水系統(RephiLe)，核酸電泳儀 EPS100 (上海天能)。

細菌基因組 DNA 提取試劑盒(Axygen)，dNTP (Takara)

三、試驗方法

1、樣品制備和增菌培養

接種前，先將增菌培養基煮沸 10 ~ 15 min，以排除溶解于培養基中的氧，并迅速冷卻，切勿搖動。每 15 ml 增菌肉湯中接種 1 ~ 2 g 固體食品或 1 ~2 ml 液體食品，接種時將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管庖肉培養基，置 35 ℃±1 ℃，同時接種兩管 TPYG 培養基，置 28 ℃±1 ℃，厭氧培養 5 d。檢查培養物的濁度、產氣、肉粒的消化和產生的氣味。若有生長，按步驟 2 分離純化培養物。若未見生長，則繼續培養 10 d。

2、分離純培養物

取 1 ~ 2 ml 培養液置于無菌試管中，加入等量無菌無水乙醇，混勻，放置室溫 1 h。用接種環取 1 ~ 2 環經處理過的培養物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種，35 ± 1 ℃ 下厭氧培養 48 h。接種可疑菌落到 TPGY 培養基，35 ± 1℃ 下厭氧培養 24 h。

3、DNA 模板制備及濃度測定

取1.4 ml TPGY 培養物轉移到 1.5 ml 離心管中，14000 r/min 離心 2 min，棄去上清液。沉淀使用商品化細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA，按照試劑盒說明書進行操作。提取的 DNA 進行純度和濃度測定后置于 -20 ℃ 保存。

4、PCR 擴增

采用分別針對 A、B、E、F 型肉毒梭菌肉毒毒素基因設計的型特異性引物(見附表1)，進行多個 PCR 擴增，每個 PCR 反應管檢測一種類型的肉毒梭菌。PCR 反應體系和參數見附表 2 和表 3。反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當的調整。PCR 檢測時反應體系應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。用 A、B、E、F 型肉毒梭菌的基因組 DNA 作陽性對照，用非肉毒梭菌基因組 DNA 作陰性對照，用無菌超純水作空白對照。

5、凝膠電泳檢測 PCR 產物

用 0.5 X TBE Buffer 制備 1.2%~1.5% 的瓊脂糖凝膠(凝膠加熱融化后冷卻至 60 ℃ 左右加入 EB 至 0.5 μg/ ml)，將 10 μL 的 PCR 產物與 2.0 μL 6 X 加樣緩沖液混合，上樣，最左邊孔道加 DNA Marker。0.5 X TBE Buffer，10 V/cm 恒壓電泳，根據溴酚藍的移動位置確定電泳時間，電泳檢測結果用凝膠成像系統判讀。

6、PCR 結果判定

陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現預期大小的擴增條帶，待測樣品出現預期大小的擴增條帶，判定為 PCR 結果陽性，按 GB/T4789.12-2003 進行確證試驗。

待測樣品未出現預期大小的擴增條帶，判定 PCR 結果為陰性，直接報告結果。

實驗中設置的陰性對照、空白對照和陽性對照 PCR 檢測結果應符合上述情況，否則，任一種對照如果出現非上述正常結果，應重做實驗。

表1　肉毒梭菌肉毒毒素基因 PCR 檢測的引物序列

檢測肉毒梭菌類型引物序列擴增長度/ bp

A 型正：5’-GTGATACAACAAGATGGTAGTTATAG-3’

反：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’983

B 型正：5’-GAGATGCTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’

反：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’492

E 型正：5’-CGAGGCGGTTGTCAACAATTTTAT-3’

反：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’410

F 型正：5’-GCTTCATTAAAGACGGAAGCAGTGCT-3’

反：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’1137

表2　肉毒梭菌毒素 PCR 檢測的反應體系

試劑終濃度加入體積/μL

10 X PCR Buffer1 X5.0

25 mmol/L MgCl22.5 mmol/L5.0

10 mmol/L dNTPs0.2 mmol/L1.0

10 μmol/L 正向引物0.5 μmol/L2.5

10 μmol/L 反向引物0.5 μmol/L2.5

5 U/μL Taq 酶0.05 U/μL0.5

DNA 模板-1.0

超純水-32.5

總體積-50.0

注：反應體系中各試劑的量可根據反應體系的總體積進行適當調整。

預變性擴增循環數后延伸

95℃，5 min94℃，1 min;

60℃，1 min;

72℃，1 min4072℃，1 min

注：PCR 反應參數可根據基因擴增儀型號的不同進行適當的調整

其他肉毒桿菌檢測方法簡介：

1、PCR-RFLP(限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應)

PCR-RFLP 的基本原理是用 PCR 擴增目的 DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的 DNA 片段條帶。

2、16S rRNA 分析

不同種的真細菌與古細菌間的 16S rRNA 基因是高度保守的。它常被用于對各種生物物種進行研究。

在核酸檢測中，水中的各種污染物尤其是核酸酶對檢測結果有著非常大的影響。DNase 與 RNase 會降解核酸;酶活性的發揮需要離子濃度合適的緩沖液，特別是 Mg2+ 對 Taq 酶的活性起到決定性的作用;有機物會起到非競爭性抑制劑的作用;同時，細菌會持續地釋放離子和小分子有機物，其基因被擴增也會對結果造成影響。

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