高效檢測谷物中的生物毒素

本文介紹了采用改良型QuEChERS和 Bond Elut Mycotoxin SPE樣品處理方法并結合三重四級桿液質聯用系統檢測谷物中的單端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮，在降低分析成本的同時獲得了極佳的檢測靈敏度。兩種樣品制備方法均展示了良好的線性（R2≥0.995）。與免疫吸附這種被廣泛認同的高效真菌毒素樣品凈化技術相比，本法測定加標小麥樣品（50μg/kg，n=9）的回收率范圍為72~105%（CV≤11%）。

真菌毒素是由霉菌產生的有毒次級代謝產物。其中鐮刀菌屬廣泛存在于溫帶地區生長的小麥、玉米等谷物中，一旦感染，會導致農作物減產。根據感染品種的不同，可能會產生一系列單端孢霉烯族真菌毒素，目前已知的單端孢霉烯毒素有150多種。最常見的單端孢霉烯毒素為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，而雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯酮-X、新茄鐮孢菌醇等其他單端孢霉烯毒素也有發現。它們均屬于A型或B型單端孢霉烯毒素，且具有相同的基本化學結構。玉米赤霉烯酮雖不屬于單端孢霉烯毒素，但是它也可由多種鐮刀菌產生。

歐盟委員會條例No?1881/2006規定了谷類糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的最大限量，后者的限量比原料規定的限量低。此前科研人員已成功應用氣相色譜法對A型和B型單端孢霉烯毒素進行檢測和定量，最近開發了采用LC/MS/MS同時測定A 型和B 型單端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮的方法。本文對小麥中9種單端孢霉烯毒素及玉米赤霉烯酮進行LC/MS/MS測定時采用的兩種樣品制備方法的性能進行了比較。

方法和結果

樣品制備采用改進的QuEChERS萃取法及分散SPE 法（d-SPE），或使用Bond Elut Mycotoxin SPE小柱進行的乙腈/水萃取法。分析單端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮時，采用改進的QuEChERS（5g研細樣品）和Bond Elut Mycotoxin SPE（25g研細樣品）方法進行樣品制備。

改進的QuEChERS方法

向每個裝有研細樣品的試管中加入甲醇/乙腈溶劑，渦旋。再加入含有4g MgSO4和1g NaCl的Bond Elut無緩沖鹽萃取試劑盒。劇烈振搖試管并離心。取適量上清液轉移至預先裝有PSA/MgSO4（1:3）的試管中。若所取的上清液為2ml，則稱取300mg MgSO4和100mgPSA手工制備2ml空白管。之后將樣品體積減小到1ml，使用裝有150mg MgSO4和50mg PSA的Bond Elut d-SPE萃取管進行操作。

Bond Elut Mycotoxin SPE方法

在第2種樣品制備方案中使用Bond Elut Mycotoxin SPE小柱，500mg，3ml。先將等分提取樣品流經SPE 小柱，再收集洗脫液并濃縮。SPE方法根據其非保留SPE機理，可用于清除樣品中可能干擾ESI-MS/MS檢測的基質組分。

操作條件

HPLC條件

色譜柱：ZORBAX快速分離高通量Eclipse Plus C18，2.1×100mm，1.8μm；儀器：6460三重四極桿液質聯用系統，1290 Infinity液相色譜系統；流速：0.25ml/min；柱溫：30℃；進樣體積：10μl；流動相A：水+0.2%乙酸，5mM乙酸銨；流動相B：甲醇+0.2%乙酸，5mM乙酸銨。

MS/MS條件

表1為安捷倫噴射流參數，表2為MS條件。使用MassHunter Optimizer 軟件對MRM transitions和條件進行優化。根據分析中的流動相條件和流速來優化安捷倫噴射流參數。

本方法采用快速連續的極性切換，在檢測靈敏度最高的電離模式下完成測量。方法既可采用靜態MRM檢測，也可采用動態MRM檢測。當采用保留時間窗為1min、循環時間為500ms的動態MRM時，最多同時監測12個MRM通道，最小駐留時間為31.5ms，最大駐留時間為246.5ms。為保證準確定量，500ms的循環時間要求每個色譜峰至少包含20個數據點。圖1為分析加標50ppb真菌毒素小麥基質的色譜圖。

所有真菌毒素均具有良好的線性（R2≥0.995），小麥樣品（50μg/kg，n=9）的回收率范圍為72~105%（CV≤11%）。采用改進的QuEChERS方法最終提取物的LOQ范圍為0.003~1.04μg/kg，而BE Mycotoxin SPE方法的LOQ范圍為0.002~0.66μg/kg（見表4）。

小結

加標9單端孢霉烯毒素和玉米赤霉烯酮的小麥樣品，濃度均為50μg/kg。通過與基質匹配的標準品比較計算來消除樣品提取物中的離子抑制作用。改進的QuEChERS和Bond Elut Mycotoxin SPE兩種方法均實現了分析物極佳的檢測靈敏度。具有更高吸附容量的Bond Elut mycotoxin SPE操作可使凈化更徹底，并可改善LOD（S/N＞3）和LOQ（S/N＞10）。兩種樣品制備技術的回收率范圍為72~105%。改進的QuEChERS方法速度快、通量高、溶劑和吸附劑使用量少，顯著降低了分析成本。