鼻內應用免疫調節分子：肺癌局部免疫療法的探討

實驗概要

肺癌是最常發生的癌癥類型之一。在動物模型的初步調查，成功的肺癌患者的治療需要有前途的治療試劑。本試驗描述了一種方法來誘發小鼠肺腫瘤和免疫分子，直接鼻內應用治療肺。在這里，我們描述的L1C2和B16F10分別為誘導小鼠細胞系產生肺腺癌或轉移性黑色素瘤。在這個模型中的腫瘤細胞小鼠尾靜脈注射。監測治療結果腫瘤的大小，可以用HE染色切片分析。

主要試劑

PBS(Gibco-Invitrogen；cat. no. 14190)

accutase(PAA；cat no. L11-007)

DMEM培養液(Gibco-Invitrogen；cat.no.41965-039)用于B16 - F10細胞的培養

RPMI 1640(Gibco-Invitrogen；cat.no. A10491-01)用于 L1C2細胞的培養

胎牛血清(PAA；cat.no.A11-151)

青霉素/鏈霉素(PAA；cat. no. P11-01)

臺盼藍((Biochrom AG；cat.no. L6323)

sterofundin(B Braun)

小鼠B16F10黑色素瘤細胞株(ATCC；cat. no. CRL-6475)/ L1C2腺癌細胞株((kindly provided by Prof Wiewrodt)氯化鈉(Berlin-Chemie)

主要設備

異氟醚麻醉設備(Eickemeyer Medizintechnik)使用異氟醚麻醉時

一次性移液器

Eppendorf管

紅外燈

實驗步驟

實驗設計

為了誘導L1C2腺癌，我們推薦使用Balbc / J小鼠，誘導B16 - F10黑色素瘤使用C57BL / 6小鼠。建議每只鼠尾靜脈注射2×10⁵腫瘤細胞。實驗過程需要約21天。如果使用的是其他小鼠品系而非野生型小鼠，注射細胞的數量和持續時間需要先進行測試。鼻內抗體能應用于注射腫瘤細胞后不同的時間點以及不同劑量。抗體的數量取決于你預計在肺中中和對蛋白質的量。分析腫瘤的生長，作石蠟切片，HE染色，按照標過程進行。然后分析腫瘤區域。為此，切片可以在計算機顯示器上顯示，從而確定肺腫瘤部分面積所占百分比例。為了對腫瘤進行分類，必須在光學顯微鏡(例如：Zeiss Axio Observer.D1；Axio Vision 4.7 software使用不同的放大倍數分析。

誘導腫瘤：

試劑配置：

準備DMEM培養液 10％的FCS，1％青霉素/鏈霉素，B16F10細胞和RPMI 10％FCS的 1％青霉素/鏈霉素，L1C2細胞在4°C保存。

試劑的準備：

1．準備上述所需細胞培養試劑，在37°C預熱。時間5分鐘。

解凍腫瘤細胞：

2. 將細胞從液氮中拿出，并進行溶解解凍。

3. 完全解凍后，細胞離心800rpm 7分鐘，4°C。

4．棄上清用10ml液體懸浮細胞。

5．在50毫升培養瓶中培養細胞1-2天，直到細胞達到70-80％融合。

分裂細胞：

6．倒掉培養液用10mlPBS洗細胞。

7．加入胰酶37°C孵育1 - 2分鐘。

25厘米2瓶加入胰酶0.5毫升，75厘米2培養瓶加入胰酶1毫升，175厘米2培養瓶加入胰酶2毫升

8．捶打培養瓶讓細胞脫落。

9．加入10毫升培養液終止反應，將細胞懸液轉移到試管中。

10．4°C離心7分鐘，棄上清液。

11. 重懸細胞，用75厘米2或175厘米2細胞瓶擴大培育。

收集細胞和注射：

12. 重復步驟6-10

13．用10ml液體重懸細胞。

14．加入10μL臺盼藍至細胞懸液中。

15．細胞計數，加入10μL混合液至計數板中計數。數4個小格中細胞數(Q1-Q4)

16．細胞計數公式：(Q1 Q2 Q3 Q4)/4×2 (臺盼藍稀釋度) x10⁴

17．取小鼠細胞體積(濃度2×10⁵)然后4°C離心7分鐘。

18． 用sterofundin懸浮B16 -F10細胞或RPMI懸浮L1C2細胞使其濃度為1× 10⁶細胞/ ml(200μL/ 2×10⁵細胞注入老鼠)。

19. 準備燒瓶，加入溫水。

20．將老鼠固定在注射板上，將尾巴放入三角瓶30秒，或者尾巴也可以使用紅外線燈加熱。

21．注射器取200μL細胞懸液。

22．注射器水平插入尾部靜脈，緩慢注入細胞懸液。

鼻內應用：

試劑設置：

準備滴鼻治療的試劑，并儲存在冰上。為此目的，根據試劑盒稀釋抗體或治療分子濃度(緩沖液中含牛血清白蛋白)。稀釋的抗體或其他的治療分子，幾個星期，可以儲存在-20°C。注意：鼻內應用量應該是25 - 40μl。

準備麻醉劑：

將1g2，2，2-三溴乙醇溶于1ml，T -戊醇.

加入39毫升PBS漩渦，直到全溶解。

將溶劑4°C避光保存。。

氯胺酮(12mg/ml)/ xylazin(0.088ml/ml)溶解于PBS，4°C保存。

氯胺酮可以儲存在4°C的幾個星期。

注意：所有的實驗中，應根據國家和機構的關于動物護理和使用的指導方針進行。

23. 根據要求準備抗體，儲存在冰上。

24. 麻醉小鼠。(這一步可以使用選項A，B或C )

   A. 老鼠腹腔注入200μ三溴乙醇。

   B. 腹腔注入60-70μL的氯胺酮。

   C. 使用異氟醚系統。

25. 當小鼠處于麻醉狀態時心臟跳動越來越慢，鉗住脖子使其后腦勺傾斜。仔細的滴入溶液，使液滴從鼻子能通到嘴里，讓小鼠嘴也能吸到溶液。

26. 等待小鼠蘇醒。鼠三溴乙醇和氯胺酮治療后需要大約30分鐘才能清醒。麻醉持續時間約5分鐘后，異氟醚治療。使用紅外線燈暖鼠標，直到它清醒。

注意：如果您使用氯胺酮或三溴乙醇麻醉，等待時間24小時后才能再次麻醉小鼠。重復使用對小鼠可能有害。