2020年版中國藥典四部：9101分析方法驗證指導原則

9101 分析方法驗證指導原則

　　分析方法驗證（analytical method validation）的目的是證明建立的方法適合于相應檢測要求。在建立藥品質量標準、變更藥品生產工藝或制劑組分、修訂原分析方法時，需對分析方法進行驗證。生物制品質量控制中釆用的方法包括理化分析方法和生物學測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學藥品基本相同，所以可參照本指導原則進行，但在進行具體驗證時還需要結合生物制品的特點考慮；相對于理化分析方法而言，生物學測定方法存在更多的影響因素，因此本指導原則不涉及生物學測定方法驗證的內容。

　　驗證的分析項目有：鑒別試驗、雜質測定（限度或定量分析）、含量測定（包括特性參數和含量/效價測定，其中特性參數如：藥物溶出度、釋放度等）。

　　驗證的指標有：專屬性、準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現性）、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗證中，須用標準物質進行試驗。由于分析方法具有各自的特點，并隨分析對象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗證的指標。表1中列出的分析項目和相應的驗證指標可供參考。

　　①已有重現性驗證，不需驗證中間精密度。

　　②如一種方法不夠專屬，可用其他分析方法予以補充。

　　③視具體情況予以驗證。

　　方法驗證內容如下。

　　一、專屬性

　　專屬性系指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。鑒別反應、雜質檢查和含量測定方法，均應考察其專屬性。如方法專屬性不強，應采用一種或多種不同原理的方法予以補充。

　　1. 鑒別反應

　　應能區分可能共存的物質或結構相似的化合物。不含被測成分的供試品，以及結構相似或組分中的有關化合物，應均呈陰性反應。

　　2. 含量測定和雜質測定

　　采用的色譜法和其他分離方法，應附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應標明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應符合要求。

　　在雜質對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質或輔料的試樣比較測定結果。對于雜質檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質之間能否得到分離。

　　在雜質或降解產物不能獲得的情況下，可將含有雜質或降解產物的試樣進行測定，與另一個經驗證的方法或藥典方法比較結果。也可用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進行強制破壞，以研究可能的降解產物和降解途徑對含量測定和雜質測定的影響。含量測定方法應比對兩種方法的結果，雜質檢查應比對檢出的雜質個數，必要時可采用光電二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。

　　二、準確度

　　準確度系指用所建立方法測定的結果與真實值或參比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。準確度應在規定的線性范圍內試驗。準確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。

　　在規定范圍內，取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結果進行評價；或設計至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價，且濃度的設定應考慮樣品的濃度范圍。兩種方法的選定應考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。

　　1. 化學藥含量測定方法的準確度

　　原料藥可用已知純度的對照品或供試品進行測定，或用所測定結果與已知準確度的另一個方法測定的結果進行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物對照品進行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加入已知量的被測物進行測定，或用所建立方法的測定結果與已知準確度的另一個方法測定結果進行比較。

　　2. 化學藥雜質定量測定的準確度

　　可向原料藥或制劑中加入已知量雜質對照品進行測定。如不能得到雜質對照品，可用所建立的方法與另一成熟方法（如藥典標準方法或經過驗證的方法）的測定結果進行比較。

　　3. 中藥化學成分測定方法的準確度

　　可用已知純度的對照品進行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

　　4. 數據要求

　　對于化學藥應報告已知加入量的回收率（％），或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或置信區間（置信度一般為95%）；對于中藥應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收率（%）計算值，以及回收率（%）的相對標準偏差（RSD%）或置信區間。樣品中待測定成分含量和回收率限度關系可參考表2。在基質復雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當放寬。

　　此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methodsfor Dietary Supplements and Botanicals》。

　　三、精密度

　　精密度系指在規定的測定條件下，同一份均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

　　在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性；在同一實驗室內的條件改變，如不同時間、不同分析人員、不同設備等測定結果之間的精密度，稱為中間精密度；不同實驗室測定結果之間的精密度，稱為重現性。

　　含量測定和雜質的定量測定應考察方法的精密度。

　　1. 重復性

　　在規定范圍內，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當于100%濃度水平）的供試品，用至少6份的測定結果進行評價；或設計至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進行測定，用至少9份樣品的測定結果進行評價。采用至少9份測定結果進行評價時，濃度的設定應考慮樣品的濃度范圍。

　　2. 中間精密度

　　考察隨機變動因素，如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響，應進行中間精密度試驗。

　　3. 重現性

　　國家藥品質量標準采用的分析方法，應進行重現性試驗，如通過不同實驗室協同檢驗獲得重現性結果。協同檢驗的目的、過程和重現性結果均應記載在起草說明中。應注意重現性試驗所用樣品質量的一致性及貯存運輸中的環境對該一致性的影響，以免影響重現性試驗結果。

　　4. 數據要求

　　均應報告標準偏差、相對標準偏差或置信區間。樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考表3（可接受范圍可在給出數值0.5～2倍區間，計算公式，重復性：RSDr=C-0.15；重現性：RSDR=2C-0.15其中C為待測定成分含量）。在基質復雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當放寬。

　　此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methodsfor Dietary Supplements and Botanicals》。

　　四、檢測限

　　檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。常用的方法如下。

　　1. 直觀法

　　用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

　　2. 信噪比法

　　用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的被測物質最低濃度或量。一般以信噪比為3︰1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

　　3. 基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法

　　按照LOD=3.3δ/S公式計算。式中LOD：檢測限；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。

　　δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標準偏差；②標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。

　　4 .數據要求

　　上述計算方法獲得的檢測限數據須用含量相近的樣品進行驗證。應附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結果。

　　五、定量限

　　定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應符合準確度和精密度要求。對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限。常用的方法如下。

　　1. 直觀法

　　用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。

　　2. 信噪比法

　　用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算岀能被可靠地定量的被測物質的最低濃度或量。一般以信噪比為10︰1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。

　　3. 基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法

　　按照LOQ=10δ/S公式計算。式中LOQ：定量限；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。

　　δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標準偏差；②采用標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。

　　4. 數據要求

　　上述計算方法獲得的定量限數據須用含量相近的樣品進行驗證。應附測試圖譜，說明測試過程和定量限結果，包括準確度和精密度驗證數據。

　　六、線性

　　線性系指在設計的范圍內，線性試驗結果與試樣中被測物濃度直接呈比例關系的能力。

　　應在設計的范圍內測定線性關系。可用同一對照品貯備液經精密稀釋，或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5個不同濃度水平。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性回歸計算，或者可釆用描述濃度-響應關系的非線性模型。

　　數據要求：應列出回歸方程、相關系數、殘差平方和、線性圖（或其他數學模型）。

　　七、范圍

　　范圍系指分析方法能達到精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或量的區間。

　　范圍應根據分析方法的具體應用及其線性、準確度、精密度結果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%～120%；制劑含量均勻度檢查，范圍一般為測定濃度的70%～130%，特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的士30%，如規定了限度范圍，則應為下限的一20%至上限的+20%；雜質測定，范圍應根據初步實際測定數據，擬訂為規定限度的±20%。如果一個試驗同時進行含量測定和純度檢查，且僅使用100%的對照品，線性范圍應覆蓋雜質的報告水平至規定含量的120%。

　　在中藥分析中，范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗證范圍應大于被限定含量的區間。溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的±30%。

　　八、耐用性

　　耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明，并注明可以接受變動的范圍，可以先采用均勻設計確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動范圍。典型的變動因素有被測溶液的穩定性、樣品的提取次數、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動因素有不同品牌或批號的色譜柱、不同類型的擔體、載氣流速、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。

　　經試驗，測定條件小的變動應能滿足系統適用性試驗要求，以確保方法的可靠性。