麥胚提取物體外翻譯系統可用于病毒和真核細胞中 mRNA 在異種無細胞體系中的有效的翻譯
| 實驗材料 | 精胺或4.0?8.Ommol L亞精胺肌氨酸激酶新鮮麥胚沙粒 |
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| 試劑、試劑盒 | 提取緩沖液平衡緩沖液DEFC10X能量緩沖液乙酸鉀DTTLHEPESmRNA[3 H] 或 [35S] 標記的 L-氨基酸三氯乙酸（TCA)。 |
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| 儀器、耗材 | SephatkxG-25(粗級）高溫烘箱低溫冰箱高速離心機研缽電泳裝置 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
(一）麥胚提取物的制備
1)新鮮麥胚: 約5 g
2)沙粒：約5 g
3) 提取緩沖液：20 mmol/LHEPES(pH7.6)，100 mmol/LKC1，1 mmol/L乙酸鎂，2 mmol/LCaCl2, 6 mmol/L2-巰基乙醇
4)平衡緩沖液：20 mmol/LHEPES(pH7.6)，120 mmol/LKCl,5 mmol/L乙酸鎂，6 mmol/L2-巰基乙醇
5)SephatkxG-25(粗級）
6)DEFC
7)高溫烘箱
8)低溫冰箱
9)高速離心機
10)研缽
(二）mRNA 在麥胚提取物的翻譯
1)10X能量緩沖液：10 mmoL/LATP，20 umol/LGTP, 80 mmol/L磷酸肌氨酸. 應使用核苷三磷酸鉀鹽，并用NaOH調節pH至7.4?7.6。
2)0.5?1.0 mol/L乙酸鉀，25 mmol/L乙酸鎂。
3)20 mmol/LDTT。
4)0.2moL/L HEPES，pH7.4?7.6。
5)0.6?1.2 mol/L精胺或 4,0?8.Ommol/L 亞精胺，
6)mRNA: 按前面章節所述方法獲得。
7)200?500 ug/ml 肌氨酸激酶。
8)[3 H] 或 [35S] 標記的 L-氨基酸：為了檢測翻譯產物，在反應體系中加入一種經 10?50pCi 放射性標記的并且在翻譯產物中含量豐富的氨基酸。合適的比活分別是[3 H]標記的氨基酸：140 Ci/mmol ,[35S]標記的氨基酸 1Ci/mmol. 放射性氨基酸應是水溶液，因為乙醇、鹽、去污劑和某些溶劑都會干擾翻譯。乙醇應通過冷凍干燥除去；其他成分對翻譯的影響應經過事先分析確定。[35S] 標記的氨基酸必須小量分裝后置 一 70°C保存，這樣可以穩定保存六個月，一旦過此期限，其中的降解產物即亞砜類物質就會對翻譯產生抑制作用。
9）三氯乙酸（TCA)。
10)電泳裝置。
二、操作方法
(一）麥胚提取物的制備
由于麥胚體外翻譯系統的組分對溫度十分敏感，故應于一70°C以適當體積分裝保存，并盡量減少凍融次數。整個實驗過程都應在滅菌條件下進行。為了防止RNase污染，所用器材需經高溫處理(25C°，8 h)或先經DEPC處理，然后用滅菌蒸餾水徹底清洗。制備過程須在4°C進行；最好使用塑料容器，因為起始因子容易粘在玻璃器皿上
1)將新鮮麥胚（約5 g)與等質量的沙粒混合，并逐漸加入28 ml提取緩沖液一起研磨。
2) 混合物以28OOOg在 2℃、pH6.5的環境中離心10 min,pH6.5這樣的pH可防止內源 mRNA從多聚梭糖體釋放下來，因而也就無需預先溫育以促使多聚核糖體的形成。
3)將上清液加到用平衡緩沖液平衡的SephadexG-25 凝膠柱上，洗脫回收，以去除內源氨某酸和對翻譯有抑制作用的植物色素。然后，對凝膠柱進行反向層析，以回收凝膠柱中的氨基酸。
4)合井OD260>20 的組分，以 OD260 約為 100 的濃度分裝，保存于一70℃。提取物翻譯活性可以保持一年以上。
(二）mRNA 在麥胚提取物中的翻譯
所有制備操作都應在冰上進行。齊種組分用過后的剩余部分應用干冰快速冷凍。反應在滅菌塑料微型離心管中進行
1)混合下列溶液 (總最 60ul):5ul 能量混合液，5ul 乙酸鉀/乙酸鎂溶液，5ulDTT，5ulHEPES,5ul 精胺,10ul(0.3?8.0ug)mRNA 水溶液，10ul 麥胚提取物，lOul肌氨酸激酶 (〇 D260=0.8?1.0) 和 5ul[5 H]或[35S]標記的L-氨基酸。肌酸激酶應最后加入以避免能量浪費。輕微振蕩離心管使溶液混勻。如果需要，可在肌酸激酶之前加入微粒體膜 (OD260=0.5) 以檢測翻譯產物的修飾加工作用.
2) 于 28℃ 保溫 lh。置 4℃ 終 lh 反應進行。
3) 取一部分反應液進行 TCA 沉淀以檢査放射性氨基酸摻入翻譯產物的情況
4) 對剩余的體外翻澤產物可通過離子交換層析等實驗做進一步的分析。但對于專-性的產物，可先進行免疫沉淀，然后用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
收起 |
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| 注意事項 | 1)提取物的翻譯活性隨不同批號的麥胚材料不同而不同。
2) 麥胚提取物系統中外源mRNA 刺激的放射性氨基酸摻入翻譯產物的效率一般沒有網織紅細胞裂解液屮的高。
3) 麥胚提取物的翻譯活性對鉀離子濃度的變化特別敏感. 鉀離子濃度低于 70 mmol/L 時，比較小的 mRNA 優先得到翻譯，而較大的 mRNA 的完全翻譯則要求 70 mmol/L 或更髙濃度的乙酸鉀。在適當的離子條件下，能合成大到 200kDa 的多肽。另外，由于氯離子對翻譯有抑制作用，所以最好使用乙酸鉀。RNA 制備物中殘留的鉀離子應逋過 70% 乙醇洗滌徹底除盡，
4) 由于大部分內源氨基酸都已通過 SephadexG-25凝膠層析被除掉，所以根據所用麥胚提取物的量，有時可能有必要加入氨基酸 (終濃度 25uol/L 和/或 tRNA(終濃度 58ug/ml) 以使其翻譯活性最優化
5) 加入精氨或亞精胺通常能促進翻譯，尤其是對子合成較大的多肽更為必需，這可能是因為它們對較大的 mRNA 分子具有穩定作用。若省略精氨或亞精胺，則需將乙酸鎂的最適濃度提高到 4.0?4.3 mmol/L。
6) 對麥胚提取物體外翻譯系統來說，HEPES 的緩沖效果比 Tris-乙酸好。如果使用后者，則鉀離子和鎂離子的最適濃度都需隨之改變。
7) 有些商品化的肌氨酸激酶存在著不同程度的核酸酶污染，因此，如果肌氨酸激酶的用量較大，必須考慮到這一點。
8）較大的 mRNA在下加熱 1 min, 然后在冰上快速冷卻，這樣可以提高它們在麥胚提取物系統中的翻譯效率。
9) 向翻澤反應系統屮加入狗胰腺微粒體膜可檢測翻譯產物的加工過程。
10)mRNA 刺激的放射性氨基酸摻入翻評產物的過程是線性的：先有一個 5 min 的延滯期，接著是的線性 t：升期 dOmin 后此過程全部完成。這一系統在高于 30℃ 的溫度屮是不穩定的，其最高活性隨不同批號的麥胚提取物制品而異，其孵肓溫度一般在25?30℃ 之間。而常用的孵育溫度是 28℃
11) 為得到最高的翻譯活性，須對每一次的麥恥提取物制品分別確定其最佯的反應條件，包括 mRNA 濃度、鉀離子和鎂離子濃度以及孵存溫度等，還須考慮麥胚提取物柱層析洗脫液中各種鹽的濃度。 |
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