CRISPR新應用：尋找基因調控元件

　　人體內所有的組織都是由蛋白質構成的，每一種蛋白質都是由人類基因組中一段DNA“編碼”的。

　　但是這些編碼區僅占基因組的大約百分之1，而分散在基因組中的其他百分之99的序列，參與了調節基因的表達，或決定哪些編碼區將被翻譯成蛋白質，以及何時被翻譯。

　　1月25日在《Nature Biotechnology》雜志發表的一項研究中，麻省理工學院（MIT）和哈佛醫學院的研究人員描述了一種新的技術，可系統而有效地在長的基因組片段中尋找調控元件。在這項技術的第一次應用過程中，他們發現了證據表明，當前人們對于基因調控的看法是不完整的。

　　本文資深作者、麻省理工學院電氣工程和計算機科學教授David Gifford說：“傳統的檢測方法是將基因組切成小片段，并探討它們是否足以推動基因的表達。這有兩個局限性。第一，可能一些事情足以激活基因，但這并不意味著它是必要的。反之亦然：如果有什么事情是必要的，它可能就不是充足的。所以這些實驗確實沒有揭示關于基因組DNA功能的完整故事。”

　　Gifford補充說：“這些實驗的另一個問題是，它們并不是在天然的背景下完成的。就是說，切割的DNA片段并不位于基因組中正常的位置。我們想用一種直接的檢測法，揭示基因組序列在其原生環境中的必要性——在細胞中，它通常位于基因組中經常逗留的位置。我們就在它發揮正常作用的位置突變它。”

　　該研究的第一作者是Gifford課題組的博士后Nisha Rajagopal。哈佛醫學院研究員Richard Sherwood是共同資深作者。

　　未標記的路徑

　　在最近幾年，在基因組中確定調控元件的主要技術，一直是使用所謂的組蛋白標記。在細胞中，DNA通常被裹緊纏繞在組蛋白周圍。組蛋白的末端經常有修飾——如乙酰基或甲基原子團的添加。

　　這些修飾是組蛋白標記，某些標記似乎與基因表達的抑制或促進有關。生物學家找到攜帶這些標記的組蛋白，切出纏在它們周圍的DNA片段，并對DNA進行測序。當他們在基因組圖譜中找到相應的序列時，他們就可以開始仔細地進行有針對性的實驗，試圖找出調控元件。

　　然而，麻省理工學院和哈佛大學的研究人員，已經確定了在基因調控中發揮關鍵作用的基因組區域，但之前這并沒有與組蛋白標記聯系起來。Gifford 說：“科學總是經歷一系列的假設。在我看來，這項研究表明，仔細考慮我們的假設，是很重要的。它沒有直接反駁假設，但在一定意義上，要求我們對‘對基因組功能來說什么是必需的’做進一步的探索。”

　　Gifford及其研究小組開發的這項技術，是CRISPR基因編輯系統的一個應用。CRISPR是一種切割DNA的方法。在這篇新論文中，研究人員對四個已知蛋白編碼區域中的每一個區域周圍的數萬個堿基對（或DNA字母），進行了徹底搜查。

　　RNA引導

　　為了定期進行切割，研究者設計了4000個引導RNA——將CRISPR切割酶引導到基因組中正確位置的生物小分子。

　　在實驗中，引導RNA是在細胞內制造的。對于所有的引導RNA，研究人員構建了DNA模板，細胞可自然吸收。平均而言，每一個DNA模板在大約 1000個細胞中顯示出來。每個細胞都將一個DNA模板精確地轉化為引導RNA，這引導著CRISPR切割酶到達基因組中的特定位置。

　　在每一個這樣的位置上，CRISPR酶會切割DNA。當細胞試圖修復那些切口時，修復部位的DNA序列會變得混亂。在某些情況下，這種干擾會阻止細胞制造相應的蛋白質，從而說明功能區域的重要性。

　　研究人員隨后進行了一組實驗，只靶定這些區域，以確定某些精確序列——其修飾會中斷蛋白質的生產。在他們調查的四個蛋白質編碼序列的每一段序列周圍，他們發現了大約1000個堿基對的片段，它們顯示出強烈的調控活性的跡象，但這些組蛋白標志以前沒有描述過。

　　Gifford說，有可能是，這些片段僅存在于一小部分細胞中，并且，它們實際上與組蛋白標記有關；確定組蛋白修飾的標準技術，依賴于整個細胞群體的平均測量值，所以有可能錯過了異常值。Gifford、Rajagopal及其同事正在繼續調查這些區域，來確定它們當中發生了什么。

　　新年伊始，CRISPR技術的新應用可謂是如雨后春筍，例如，加州大學任兵教授帶領的研究團隊，開發了基于CRISPR/Cas9的高通量篩選策略，并由此發現了一類新型增強子。這項研究發表在一月二十六日的Genome Research雜志上。而中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組，則首次利用CRISPR技術直接調控內源性基因表達，將胚胎干細胞分別誘導為胚外滋養層干細胞和原始內胚層細胞，成功實現早期胚胎細胞之間的譜系轉換，研究結果發表于Nature子刊《Scientific Reports》。相信2016年將會是CRISPR技術繼續大放異彩的一年。