CRISPRCas9基因編輯技術在三大熱門腫瘤免疫治療中的應用

　　基因編輯技術是對某一核苷酸序列中的特定基因位點進行人為改變，插入、刪除、替換或修飾基因組中的特定目的基因使其表達性狀改變的一種新興分子生物技術。CRISPR -Cas9作為一種新興的基因編輯技術，通過定向敲除腫瘤免疫檢查點分子或者通過快速簡便的基因編輯，而被廣泛應用于腫瘤治療領域，其顯著降低了腫瘤免疫治療的操作難度，同時也極大促進了腫瘤免疫治療研究的發展。因此，本文就其在CAR-T、免疫檢查點、抗體靶向療法這三大主要腫瘤免疫療法中的應用進行簡要論述。

　　在CAR-T療法中的應用

　　CAR-T細胞免疫療法是多腫瘤免疫療法中最熱點的研究內容。CAR-T技術通過基因編輯獲得修飾后的T細胞，能夠特異性識別腫瘤細胞表面特異性受體，并增強其對腫瘤細胞的防御能力。

　　提高CAR-T細胞的制備效率

　　CAR-T療法通過采集患者的T細胞進行基因修飾，成為CAR-T細胞后輸入患者體內，過程用時長、難度高且成本大，還有T細胞自身的治療數量限制。而 CRISPR-Cas9基因編輯技術能明顯提高CAR-T細胞的制備效率，其對一個正常的免疫T細胞進行基因改造，在引入CAR序列時去除T細胞內源性αβT細胞受體基因和人白細胞抗原 I（HLA I）類編碼基因，以防止用于不同患者時產生抗宿主反應。

　　提高CAR-T細胞的功能

　　CRISPR-Cas9 技術也可以通過敲除編碼信號分子的基因或T細胞抑制性受體的基因來提高CAR-T細胞的功能。

　　CAR-T細胞療法的抗腫瘤療效顯著，但只能夠特異性識別腫瘤細胞表面受體，而腫瘤特異性T細胞受體（TCR-T）細胞能夠通過基因修飾表達特異性受體，識別腫瘤細胞表面經I類主要組織相容性抗原呈遞的抗原肽從而識別胞內特異性分子。但受體T細胞中存在的內源性TCR與修飾后的TCR可能會存在競爭反應，因此采用CRISPR-Cas9 基因編輯技術制備TCR、HLA I 類分子和PD1缺失的CAR-T細胞，使其異體反應降低又不引起抗宿主疾病，體內抗腫瘤療效也得以提升。

　　其還能通過敲除免疫共抑制通路或信號分子的基因（如CTLA4、PD1）提高CAR-T細胞的功效。

　　科學家運用CRISPAR-Cas9 技術有效地對CAR-T細胞進行基因編輯，得到多基因敲除CAR-T細胞，防止免疫調節物對 T細胞活化與增殖的影響，成功提高CAR-T細胞對免疫細胞的防御作用，更好地發揮抗腫瘤療效。

　　NIH（美國國立衛生研究院）下屬Recombinant DNA Advisory Committee批準的由Carl June教授領導的一項CRISPR臨床試驗。在該試驗中，研究人員將利用CRISPR-Cas9在靶向黑色素瘤的CAR-T中敲除編碼PD-1的基因以及內源性T細胞受體的基因，敲除PD-1之后，CAR-T的殺傷性更強。

　　2017年12月，中國科學院王皓毅團隊在Frontiers of Medicine上發表了一篇名為CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells的文章，該研究團隊建立了利用CRISPR-Cas9系統在T細胞或CAR-T細胞中高效敲除LAG-3基因的方法，其發現敲除LAG-3的CAR-T細胞能夠維持抗原特異性細胞因子釋放和體內外抗腫瘤功能。

　　美國斯隆凱特林癌癥紀念中心的研究人員利用CRISPR-Cas9技術運送CAR基因到T細胞基因組中的特定位點上，利用這種方法構建出更加強效的CAR-T細胞。而這些CAR-T細胞不容易耗竭，能夠長時間地持續發揮抗腫瘤作用。

　　來自圣路易斯華盛頓大學醫學院的科學家們利用基因編輯技術CRISPR對人類T細胞進行了改造，去除了CD7和T細胞受體α鏈(TRAC)表達，這是一種針對CD7+ T細胞惡性腫瘤，避免了“自相殘殺”的CAR-T細胞療法(UCART7)。其在保護正常T細胞的情況下，對癌性T細胞發起攻擊。其研究結果顯示：接受基因編輯改造的以CD7為靶點的T細胞治療組的小鼠，中位生存期為65天，而接受對照組小鼠的中位生存期僅有31天。研究結果于發表在權威學術期刊Nature子刊Leukemia上，

　　CRISPR技術在CAR-T細胞的基因修飾方面的應用，具有廣闊的應用前景。但目前還存在兩個限制性問題：

　　CRISPR技術導入T細胞的方法不能使普通細胞正常增殖，限制了細胞培養和富集過程。導入方法中，非整合轉染方法雖安全但效率低，整合轉染的方法效率較高但其安全性不能保證。

　　CRISPR編輯系統存在脫靶現象，一旦發生脫靶，將導致非靶標基因的改變或調控元件的破壞，會造成不可逆轉的后果。因此CAR-T細胞的精確編輯和高效導入是基因編輯技術未來主要的研究方向。

　　在免疫檢查點中的應用

　　PD-1和CTLA-4是如今十分熟知的免疫檢查點，能顯著抑制T細胞的活性，進而使得腫瘤細胞易于逃逸機體免疫機制，導致T細胞治療效果較差。目前為了更好發揮T細胞腫瘤治療的療效，利用免疫檢查點抑制劑的阻斷抗體是常用的阻斷免疫調節物對T細胞的免疫應答抑制有效方法。

　　其中通過CRISPR-Cas9 基因編輯技術敲除參與免疫負調節的基因，也能達到同樣的抗腫瘤效果，是一種全新的治療思路。利用電穿孔方法將Cas9和sgRNA導入T細胞并敲除PD-1基因，使其表達減少，長時間的體外培養過程中沒有發現PD-1對T細胞活化的影響，使T細胞更好地發揮其抗腫瘤療效。這種新的阻斷療法常常與過繼性T細胞免疫療法結合使用，可以增強免疫細胞的活性。

　　CAR-T領域的先驅者Carl June教授在Clinical Cancer Research雜志上發表的文章證實，體外和動物模型研究中，用CIRSPR技術敲除TCR和B2M這兩個和免疫排除有關的基因后，T細胞同種異體反應性降低，且沒有導致GVHD。

　　此外，中國和英國科學家也發現，用CRISPR敲除TRAC （T cell receptor alpha constant chain）后可以構建的通用型CAR-T。

　　同時，這些進展表明了利用靶向基因編輯技術敲除免疫檢查點已是改進CAR-T治療實體瘤非常有希望的策略。

　　在抗體靶向療法中的應用

　　腫瘤細胞表面表達了與正常細胞不同的抗原，而這些抗原可以作為單克隆抗體識別的靶點，被抗體識別并結合，引起腫瘤細胞的死亡，從而達到抗腫瘤的目的。目前，FDA已批準的許多抗體類藥物，如抗HER2抗體、抗CD20 抗體、抗VEGF 抗體等。

　　鑒定腫瘤細胞表面的潛在特異性靶點

　　CRISPR-Cas9 基因編輯技術可以用來鑒定腫瘤細胞表面的潛在特異性靶點，進一步發展抗體的靶向治療應用。Steinhart等利用CRISPR-Cas9技術在具有RNF43 突變的胰腺導管腫瘤細胞之間進行全基因組篩查，發現Frizzled-5受體在胰腺腫瘤細胞的生長中起著關鍵作用。特異性結合Frizzled-5的抗體能夠明顯抑制荷瘤小鼠中癌細胞的增加。

　　近日，來自耶魯大學的陳斯迪研究團隊開發出篩選CD8+T細胞上與腫瘤免疫治療相關基因的CRISPR系統，并找到與腫瘤浸潤相關以及發揮CD8+ T細胞毒性殺傷的關鍵基因，其發現名為DHX37基因能抑制CD8殺傷T細胞對小鼠腫瘤的反應，敲除CD8+ T細胞中該基因后，CD8+ T細胞在體內具有更強的腫瘤殺傷能力。

　　抗體的制備

　　另外，CRISPR-Cas9 不僅可以鑒別腫瘤細胞表面特異性靶點，同時也在抗體的制備中發揮著作用。根據抗體重鏈C區氨基酸組成不同，對應的抗體可分為IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE五類，在激活補體系統、激活效應細胞以及對靶細胞的殺傷作用方面這五類抗體均存在差異，在腫瘤的抗體靶向治療中也起著不同的作用。因此，抗體類型轉換使抗體多樣化，更多地應用于抗體的靶向治療。B細胞特異性胞苷去氨酶（AID）參與了抗體類別轉換的過程，Ig基因發生類別轉換最重要的步驟是DNA雙鏈的斷裂，斷裂一般是由B細胞特異性酶如重組激活基因蛋白 1/2（RAG 1/2）和AID啟動。

　　研究者們運用 CRISPR-Cas9技術編輯人類和小鼠的Ig基因，利用CRISPR-Cas9介導的IgM+小鼠B細胞、雜交瘤細胞及人的B細胞重鏈恒定區基因高效DNA斷裂，故發生類轉換重組，實現IgM-IgG-IgA 的抗體類型轉換。通過CRISPR/Cas9 技術，可靶向編輯雜交瘤細胞或者B細胞免疫球蛋白重鏈恒定區的基因，獲得特定類別的抗體，達到抗腫瘤的目的。

　　抗體的抗原結合片段（Fab）分子量小，更易滲透進入腫瘤組織，在腫瘤的抗體靶向治療中起著關鍵作用。因此有研究了獲得只分泌抗體 Fab 片段的雜交瘤細胞，利用CRISPR-Cas9 技術刪除小鼠雜交瘤細胞的Fc段的基因，便可以更為高效簡便地獲得抗體的Fab片段，并易與其他藥物偶聯進而滲透入腫瘤組織，抗腫瘤效果更為顯著。

　　結語

　　由于CRISPR-Cas9技術操作過程中存在脫靶效應以及細胞內遞送效率低的問題，其在臨床治療上的應用存在限制，如何在不影響CRISPR-Cas9 的簡便性和高效性的同時又可以有效地降低其脫靶效應發生率，提升其對免疫細胞的轉染效率，達到理想的抗腫瘤免疫治療效果，這也將是科學家們繼續努力的方向。

　　但不可否認的是CRISPR-Cas9基因編輯技術在腫瘤免疫治療中擔任著越來越重要的角色。隨著該技術進行進一步的完善，將會使其更加廣泛地應用于基因研究，同時促進抗腫瘤免疫的臨床治療。