Cell背靠背|相分離促進緊密連接形成的機制

　　細胞連接(cell junction) 是指相鄰細胞之間、細胞與細胞外基質之間在質膜接觸區域特化形成的連接結構。細胞連接在加強細胞間的機械聯系，維持組織結構的完整性和協調不同細胞功能方面起著重要的作用。細胞連接可分為緊密連接(tight junction)、錨定連接和通訊連接三種類型。其中緊密連接廣泛存在于上皮或內皮細胞間連接的最頂端,由閉合蛋白（occludin)、密封蛋白（claudin)、連接粘附分子（JAM)、ZO蛋白等蛋白組成，其中ZO蛋白屬于細胞內的接頭蛋白將肌動蛋白纖維以及閉合蛋白（occludin)、密封蛋白（claudin)、連接粘附分子胞內區連接起來。上皮細胞通過緊密連接形成整體，防止物質的自由擴散，維持自身的極性。大量的研究已經闡明了緊密連接的主要構成蛋白以及其相關的調節機制。

　　但是，類似于神經生物學中的PSD（postsynaptic density）結構，作為一個開放式的亞細胞分區，含有如此高濃度蛋白的PSD是如何形成的，形成緊密連接的結構中的ZO等蛋白是如何高度聚集在緊密連接部位，而不會擴散到細胞內部其他區域是這一領域尚未解釋的問題。近些年，香港科技大學張明杰教授課題組2016年在Cell上報道了PSD中高豐度表達的兩個蛋白PSD-95與SynGAP在體外較高濃度下可以發生液-液相分離，為神經科學領域長期存在的關于PSD形成的問題提供了一個可能的答案 (Cell丨張明杰組破解突觸的建立與可塑性調節的機制——溫文玉解讀)。那么是否緊密連接胞內區也以同樣的方式通過一些蛋白的相分離完成這些蛋白的有序組織和高度聚集？

　　2019年10月31日，來自Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics（即首次報道細胞內相分離現象的Hyman Lab所在的機構）的Alf Honigmann課題組在Cell雜志發表了題為Phase Separation of Zonula Occludens ProteinsDrives Formation of Tight Junctions的文章，闡明了ZO 蛋白通過相分離促進緊密連接的形成，為這一領域提供了新的解釋。

　　之前的研究結果表明：1. ZO1和ZO2蛋白對于形成緊密連接是非常重要的，2. 緊密連接結構中的ZO1蛋白與細胞質中的ZO1處于高度動態交換中，3. ZO蛋白結構與PSD95等分子相似，具有多價的相互作用。這些結果都提示了ZO1可能會形成相分離。作者首先對緊密連接部位的ZO1和ZO2蛋白的濃度進行了測定，作者發現ZO1和ZO2在緊密連接位點的濃度都顯著高于在胞質中的濃度。作者進一步使用FRAP實驗證實了緊密連接處的ZO1和ZO2蛋白與胞質中的這兩個蛋白處于高度動態交換的過程中。為了進一步證明這兩個蛋白是否確實能夠發生相分離，作者在細胞中過表達了ZO1，ZO2和ZO3蛋白，作者發現，當表達量較低時候，外源表達的蛋白很好地定位到了緊密連接位點，當表達量較高時，在非緊密連接的位點這些蛋白也會高度聚集形成非常明亮的Foci，這些foci能夠相互融合、分離，顯示出了典型的液滴的特征。這一結果提示了ZO蛋白具有能夠發生相分離的特點，也證實了ZO蛋白在超過一定的濃度后就會發生相分離，提示了細胞內存在一個主動將ZO蛋白運輸到緊密連接部位的機制（后面會討論）。作者使用Latrunculin-A抑制actin的聚合后發現，f-actin與ZO蛋白形成了串珠狀的結構，并且在“珠子”處高度富集。將Latrunculin-A去除后，又恢復了原來的細胞膜環狀結構。這些實驗結果說明了ZO蛋白的相分離對于緊密連接的形成的最初階段可能具有重要作用，且該過程是被精細調控的。

　　作者進一步在體外研究ZO蛋白是否能夠發生相分離，同時研究其翻譯后修飾，特別是磷酸化修飾對于其相分離性質的影響。作者在高鹽離子濃度下純化了高濃度的ZO蛋白，將鹽離子濃度降低后，ZO蛋白自發形成了droplet結構，并且這種結構依賴于蛋白濃度，鹽離子濃度，可以相互融合，以及熒光漂白后能夠恢復。作者進一步證實了ZO蛋白的磷酸化修飾可以抑制ZO蛋白的相分離，這些實驗結果說明了ZO蛋白在體合適的環境中外可以發生相分離，并且這種相分離現象受到翻譯后的磷酸化修飾的調控。作者進一步mapping了ZO蛋白中介導相分離發生的domain，發現ZO蛋白中間的PSG（PDZ3-SH3-GuK）domain 可以發生相分離而其他的domain不能發生相分離，作者還發現了除了PSG domain，其他區域對于全長的ZO蛋白的相分離也有一定的促進作用。

　　ZO蛋白被證實可以招募和有序組織其他的蛋白到緊密連接位點，因此作者推測可能是發生了相分離的ZO蛋白對于其他緊密連接相關蛋白具有一定的選擇性，作者通過體內以及體內的實驗證實了ZO蛋白通過相分離形成的droplets對于這些蛋白具有選擇性，并不是所有的緊密連接相關蛋白都能進入“ZO droplet”，比如JAM-A。因此，通過上述實驗，證實了ZO蛋白可以通過相分離招募以及高度富集一些緊密連接相關的蛋白到相應的位點，完成緊密連接的有序組織以及一些細胞信號轉導過程。

　　ZO蛋白的相分離是否真的對于緊密連接的形成具有重要的調控作用？之前的一系列的研究已經表明，ZO蛋白介導相分離的PSG結構域的很多突變體能夠顯著抑制緊密連接的形成，但是這一結構與本身就介導了ZO蛋白與其他的緊密連接相關蛋白的相互作用，這一抑制作用是否是通過相分離介導的無法直接有效的說明。因此作者將關注點聚集在了ZO蛋白的U6結構域上，之前的研究表明該結構域不與任何的緊密連接相關蛋白結合，但是可以調控細胞的緊密連接，無U6結構與的ZO蛋白能夠增加緊密連接的組裝。作者利用體內的實驗證明ZO蛋白的C端的截斷體（保留了U6結構域），能夠抑制ZO蛋白的在細胞內的相分離現象。但是如果將U6結構域與C端一起截斷后，ZO蛋白的相分離現象顯著增強，也就是說，U6結構域抑制了ZO蛋白的相分離現象。另外的體外實驗以及體內實驗證實了ZO蛋白的U6結構域以及C段結構域雖然不直接參與相分離的發生，但是能夠調控ZO蛋白的相分離，U6可以抑制ZO蛋白的相分離，而C端結構域可以增強相分離（可能通過releasing U6 inhibition）.因此，作者將利用這些突變體來研究ZO蛋白的相分離現象對于緊密連接的作用，作者首先將細胞內的ZO蛋白敲除，回轉各個突變體，用于研究ZO蛋白相分離對于緊密連接的作用。作者發現，全長的WT的ZO 蛋白能夠很好的RESCUE由于ZO敲除導致的緊密連接形成的障礙，而C端截斷體（不能形成相分離）不能RESCUE，而U6以及C端同時截斷的可以發生相分離的截斷體可以在一定程度上恢復，另外，只截斷U6 結構域的截斷體可以顯著地RESCUE相應的表型。作者還通過體外的實驗證實了ZO蛋白的相分離對于緊密連接的重要性。因此，作者通過多種實驗，證明了ZO蛋白相分離對于細胞的緊密連接的形成具有重要的作用。

　　綜上，作者發現了ZO蛋白可以通過類似PSD（postsynaptic density）結構中的PSD95等蛋白相似的機制（多價的相互作用）通過相分離形成與膜相互作用的區室化結構，形成相分離后的ZO蛋白可以選擇性地募集另外的一些緊密連接相關蛋白，從而促進緊密連接的形成。

　　這篇文章也留下了一些問題，比如：ZO蛋白在緊密連接處高度富集，那么，最開始的ZO蛋白是如何逆濃度梯度聚集到緊密連接位點？這就需要細胞內具有一個主動轉運的機制。

　　有趣的是，同期在Cell 雜志刊發的另一篇文章Mechanosensation of Tight Junctions Depends on ZO-1Phase Separation and Flow在一定程度上回答了這一問題。這篇文章從不同的角度出發，也發現了ZO-1蛋白可以通過相分離調控緊密連接的形成。作者在研究斑馬魚的胚胎發育過程中發現在Enveloping layer (EVL) 和 Yolk syncytial layer (YSL)之間細胞連接方式逐漸從adherens junctions轉變為緊密連接。作者發現，細胞連接的肌動球蛋白骨架的張力越大，細胞連接處的ZO-1蛋白越富集。肌動球蛋白的張力通過觸發YSL內的ZO-1向緊密連接處聚集，從而將非緊密連接處的發生相分離的ZO-1向緊密連接處轉運。而ZO-1的相分離對于這一過程是必須的。

　　兩篇Cell 文章從不同的角度出發，都證明了ZO蛋白的相分離對于細胞緊密連接的形成的重要作用，從全新的角度闡述了緊密連接形成的機理，為進一步理解細胞間的連接提供了新的思路。