DNA斑點雜交方法（二）

核酸雜交法檢測病原微生物

　　核酸雜交技術是根據兩條互補的核苷酸單鏈可以雜交結合成雙鏈的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性標記的核苷酸單鏈做探針，與待檢標本中的DNA雜交來探查待檢標本中有無與之相互補的核酸。該方法特異性高，但敏感性低于PCR方法。

　　本實驗學習用非放射性標記物-地高辛(DIG)標記DNA片段作探針，用斑點雜交法檢測病原微生物DNA的方法。

　　 【原理】

　　用地高辛（DIG）類固醇半抗原標記特異DNA片段做探針，與待檢標本中DNA雜交，然后加入堿性磷酸酶標記的抗－DIG抗體（抗DIG-AP），再加入堿性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待檢標本中有與探針同源的DNA序列，則探針與其雜交并與抗DIG-AP結合，堿性磷酸酶催化底物呈色，則在雜交膜上出現蘭色斑點或條帶。該探針可用于斑點雜交，菌落原位雜交及Southern blot雜交。

　　　（一）DIG-DNA探針的制備（隨機引物法標記）

　　　【材料】

　　　　1. 待標記DNA (0.5~3ug)

　　　　2. 六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)

　　　　3. dNTP標記混合物，Klenow enzyme

　　　　4. 其它試劑4M LiCl，無水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0

　　　【方法】

　　　　1. 取待標記DNA(0.5~3ug)，加無菌去離子水至終體積15ul，于沸水浴變性10分鐘后迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　　2. 在冰／氯化鈉上添加：

　　　　2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)

　　　　2ul dNTP mix

　　　　1ul Klenow enzyme

　　　　3. 混勻并短暫離心，然后于37℃孵育至少60分鐘。

　　　　4. 加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反應。

　　　　5. 加入2.5ul 4M LiCl及75ul經-20℃預冷的無水乙醇，充分混勻， -70℃放置30分鐘或-20℃放置2h。

　　　　6. 12000rpm/min離心15min，用50ul預冷的70％乙醇洗滌沉淀物。

　　　　7. 真空短暫干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。

　　　【說明】

　　　　DIG標記的DNA片斷大小為200~1000bp。每次標準標記反應模板DNA量為0.5~3ug，如標記大量DNA需相應增加反應物和反應體積。若延長37℃孵育時間(到20h)可增加DIG標記產物量。

　　　　（二）斑點雜交法

　　　【材料】

　　　　1. 硝酸纖維素膜，待檢標本DNA

　　　　2. 標準預雜交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10體積的10倍濃縮阻斷液(含變性并剪切的鮭精DNA)。

　　　　3. 洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。

　　　【方法】

　　　　1. 雜交膜的制備

　　　　①將從待檢標本提取的核酸（質粒或 染色體DNA）100℃ 10 min 煮沸變性，迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　　②膜的處理：用2×SSC ，濕潤均勻，37℃烘干后，即可點樣

　　　　③點樣：取變性待檢核酸1ul 點在硝酸纖維素膜（0.45um）上，同 時設陽性和陰性對照，室溫干燥。

　　　　④80℃真空干燥2h，將DNA固定于膜上。

　　　　2. 預雜交及雜交

　　　　①預雜交：將雜交膜放入裝有適當體積預熱的標準預雜交液的雜交 袋或雜交杯中 ，37℃預雜交 30分鐘，輕輕攪拌使膜在該溫度下孵育。

　　　　②將DIG標記的DNA探針置沸水浴5min后，迅速用冰水冷卻以變 性DNA探針。

　　　　③將變性的DIG標記DNA探針加入到預熱的標準預雜交液(2.5ml／ cm2)中并充分混勻。

　　　　④將雜交膜放到含DIG標記探針的雜交液中。輕輕攪拌，在68℃ 孵育至少6h（對于檢測微量DNA中的單拷貝基因則需孵育16h）。

　　　　⑤雜交后洗滌：用足夠量的2×SSC，0.1%SDS室溫漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過程中需不斷輕輕攪拌。

　　　　（三）免疫學檢測

　　　【材料】

　　　　1. 馬來酸緩沖液（0.1M馬來酸，0.15M Nacl。pH7.5）

　　　　2. 洗液（馬來酸緩沖液加入0.3％吐溫20(v/v)）

　　　　3. 阻斷液（10×濃縮的阻斷液經馬來酸緩沖液10倍稀釋，新鮮配制）

　　　　4. 檢測液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃預熱）

　　　　5. 顯色基底液（加200ul NBT/BCIP濃縮液到10ml檢測液中，新鮮配制）

　　　【方法】

　　　　1. 將經過雜交和嚴格清洗后的膜用馬來酸緩沖液漂洗1~5min；將膜在l00ul阻斷液中孵育30min。 　　

　　　　2. 用阻斷液稀釋抗D1G抗體至適宜濃度(1：5000左右)。

　　　　3. 傾出封閉液，將膜在20ml抗DIG抗體溶液中孵育膜30min；馬來酸緩沖液洗膜2次，每次15min，再用2m1檢測液平衡膜2~5min。

　　　　4. 將雜交膜在現配制的顯色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密閉保存（顯色過程中不能搖動）。

　　　　5. 幾分鐘內可有顏色沉淀形成（16h完成反應，反應過程中可短暫暴露于陽光下以觀察反應進展）。

　　　　6. 當顏色斑點（或條帶）達到一定強度后，可用50ml去離子水或TE溶液洗膜5min以中止反應。 　　

　　　　7. 顯色后的濾膜可封存于聚乙烯袋內或拍照片保存。