DNA測序

ABI  PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司ZL的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。

它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。

由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。

PCR產物 單鏈DNA 質粒DNA

測序反應試劑盒 去離子水 三蒸水 醋酸鈉 冰醋酸 模板抑制試劑 pGEM-3Zf (+) 雙鏈DN M13(-21)引物

PCR管 PCR儀 測序膠 全自動DNA測序儀 高速離心機 離心管 移液槍 槍頭 槍頭盒

一、準備工作

1.  BigDye測序反應試劑盒  主要試劑是BigDye Mix，內含PEZL四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。

2.  pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板  0.2 g/L，試劑盒配套試劑。

3.  M13(-21)引物  TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 umol/L，即3.2 pmol/ul，試劑盒配套試劑。

4.  DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1 ul為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/ul。

5.  引物需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/ul。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6.  滅菌去離子水或三蒸水。

7.  0.2 ml或和0.5 ml的PCR管  蓋體分離，PE公司產品。

8.  3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2)  稱取40.8 g NaAc·3H₂O溶于70 ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌后分裝。

9.  70%乙醇和無水乙醇。

10.  NaAc/乙醇混合液  取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。

11.  POP 6測序膠  ABI產品。

12.  模板抑制試劑(TSR)  ABI產品。

13.  10x電泳緩沖液  ABI產品。

14.  ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀。

15.  2400型或9600型PCR儀。

16.  臺式冷凍高速離心機。

17.  臺式高速離心機或袖珍離心機。

二、PCR測序反應
 

1.  取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：

所加試劑                                 測定模板管          標準對照管

BigDye Mix                                   1 ul                  1 ul 

待測的質粒DNA                             1 ul                    －

pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA                 －                    1 ul 

待測DNA的正向引物                       1 ul                    －

M13(-21)引物                                 －                   1 ul 

滅菌去離子水                                2 ul                  2 ul 

總反應體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
 

2.   將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min后進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環，擴增結束后設置4℃保溫。
 

三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
 

1.   將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5 ml EP管中。
 

2.  加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
 

3.   加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
 

四、電泳前測序PCR產物的處理
 

1.  加入12 μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
 

2.   將溶液轉移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
 

3.  在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。
 

五、上機操作  

1.  按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。

2.  儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。

3.  電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。

4.  每一個樣品電泳總時間為2.5 h。

5.  電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。
 

六、序列分析

儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。
 

七、儀器清洗

測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
 

八、計算
 

1.  測序反應精確度計算公式：100%－差異堿基數(不包括N數)/650x100%。
 

2.  差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。

1.  ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。

2.  本實驗測序PCR反應的總體積是5 ul，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束后PCR液小于4～4.5 ul ，則此PCR反應可能失敗，不必進行純化和上樣。

3.  作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產物需30～90 ng，單鏈DNA需50～100 ng，雙鏈DNA需200～500 ng，DNA的純度一般是A₂₆₀ nm/A₂₈₀ nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2 pmol/ul 較好。

4.  本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環測序試劑盒，一般可測DNA長度為650 bp左右。本儀器DNA測序精確度為(98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650 bp，則需設計另外的引物。為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。對于N堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。為提高測序的精確度，根據星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進一步核對。