DNA片斷的樹脂回收技術

實驗概要

目的DNA片段的回收技術是重組DNA中的關鍵技術，回收是指從電泳介質中純化出目的片斷。目前待回收的片斷主要有酶切片斷和各種PCR片斷；回收的介質主要有瓊脂糖和PAGE；回收的方法主要有樹脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮凍凍融回收及透析袋大量回收等，下面分別介紹樹脂、微量柱及液氮凍凍融回收技術。
樹脂回收特別適合于PCR片段的回收，具有純度高、操作簡潔等特點，經此方法回收的片段可有效的用于重組載體構建。通過15分鐘的純化過程，PCR產物即能被有效地從含引物二聚體、非特異性擴增引物片斷等混合物中分離出來，成為高度無鹽的、不含其他大分子成分的純化片斷。在較寬的分子量范圍內有較高的回收效率。下表為不同長度的DNA片斷，在室溫條件下，用此純化系統直接純化時，各自相應的回收率。

dsDNA長度bp     200        1500            300              200              75                50

回收率%           ≥ 60          96                99                69                3                  2

主要試劑

PCR片斷純化試劑盒  80％異丙醇

主要設備

離心機  電泳議  電泳槽  取液器  微量真空裝置  抽濾裝置

實驗步驟

1. 從瓊脂糖介質中純化DNA片斷

   1) 用低熔點或常規熔點瓊脂糖電泳對PCR擴增片斷進行分離，該電泳安常規方法進行，緩沖液為TAE.

   2) 在凝膠上，找到所需條帶，然后用潔凈并滅菌的小刀將其切下接近300微升瓊脂糖凝膠 (約300毫克)

   3) 如果切下的瓊脂糖為高融點的則安下面A步驟進行，如為低融點瓊脂，則安B步驟進行。

      A. 將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，加入1毫升純化用樹脂，然后將其置于65℃水浴保溫5分鐘，或保溫至瓊脂完全溶解。

      B. 將300微升瓊脂塊放進1.5毫升的微量離心管中，然后將其置于70℃水浴保溫至瓊脂完全溶解，然后加入1毫升純化用樹脂到融化好的瓊脂中，將其混合20秒，但不要振動。

    4) 為每一個待回收片斷準備好一個微量柱. 在每個柱的開口處，聯上一針筒，然后將這些柱與針筒的復合體與抽真空設備相連

   5) 在柱-針筒復合體中加入樹脂/DNA混合物，打開真空裝置，將樹脂與DNA的混合物抽到 微量柱中，斷開真空裝置與柱的連接。

   6) 洗柱，加入2毫升80%的異丙醇，打開真空裝置，使這些洗柱液完全流經微量柱。

   7) 繼續真空30秒以干燥樹脂，注意此干燥時間不能超過30秒。關閉真空，移去針筒。將微量柱轉移至一1.5毫升微量離心管中。10000g離心2分鐘，以徹底除去殘存的異丙醇。

   8) 將微量柱，再轉移至一新的1.5毫升微量離心管中，加入50微升水或TE緩沖液，靜置1分鐘(在頭30秒，DNA仍將吸附于柱上)，10000g離心20秒，以洗脫DNA片斷，所得純化后的DNA片斷可直接用于連接反應或在-20℃保存。
2. 尿素丙烯酰胺變性膠中分離DNA片斷

   1) 從變形膠上切下待回收片斷，將其放如一微量離心管中。

   2) 加入100微升TE緩沖液，37℃保溫30分鐘以上。

   3) 將上清液吸入一新管中，加入1毫升樹脂，振蕩20秒以混勻樹脂與清液。

   4) 其余步驟同1。

注意事項

1. 對于>3Kb的片斷在純化回收時，洗脫前，如先將水或TE緩沖液預熱到65-80℃，則將能有效的提高回收率。待洗脫片斷>3Kb時，洗脫液溫度應為65-80℃;待洗脫片斷>20Kb時，洗脫液溫度應達80℃。

2. 應用TAE緩沖液，而不應用含TBE的膠，因硼酸能與瓊脂糖中的方式糖單體或多聚體結合成難溶復合物，這種復合物使膠難熔解。

3. 在取用純化柱樹脂中的液體前，應將樹脂充分攪勻，如樹脂中出現結晶或結塊，則應將樹脂在25-37℃，溫熱10分鐘，冷卻至30℃使用。樹脂本身不會溶。

4. 在紫外光下觀察切割條帶時，操作要快，DNA條帶在紫外光下的暴露時間應盡量短，因UV會引起DNA變異。