DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗原理和操作步驟

一、實驗目的
瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經濟快速等優點。本實驗學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術，掌握有關的技術和識讀電泳圖譜的方法。

二、實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而 pH8.0-8.3時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。在中性或堿性時，單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳動率大致相同。
影響核酸分子泳動率的因素主要是：
1、樣品的物理性狀
即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言，電荷密度愈大，泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明顯。
對線形分子來說，分子量的常用對數與泳動率成反比，用此標準樣品電泳并測定其泳動率，然后進行DNA分子長度（bp）的負對數-——泳動距離作標準曲線圖，可以用于測定未知分子的長度大小。
DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大，比如質粒分子，泳動率的大小順序為：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現相反的情況。
2、支持物介質
核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同，是于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。
瓊脂糖凝膠適合分離長度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp）的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。
3、電場強度
電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，不超過4V/cm。而對于大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。
4、緩沖液離子強度
核酸電泳常采用TAE、 TBE、TPE三種緩沖系統，但它們各有利弊。TAE價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環。TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響后續反應。所以多采用TBE緩沖液。
在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護DNA。
緩沖液pH常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復合物時，出現不同的效應。254nm的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。
使用溴化乙錠對DNA 樣品進行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻入DNA分子中，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，但是如果要測定核酸分子大小時，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結束后，把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min進行染色。BE見光分解，應在避光條件下4℃保存。

三、材料、試劑及器具
1、材料
ΛDNA/HindⅢ Marker（分子量標準）；實驗37的質粒提取物；實驗39的酶切產物；實驗40的連接產物。
2、試劑
加樣緩沖液（6x）：0.25% 溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）；酶液（10mg/ml）。
3、器具
（1）電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
（2）紫外透射儀。

四、操作步驟

1、按所分離的DNA分子的大小范圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60℃左右，在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。
2、取有機玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。
3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。
4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
5、在槽內加入0.5×TBE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面
6、把待檢測的樣品，按以下量在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
1μl加樣緩沖液（6×）+5μl待測DNA樣品
〔+0.5μlEB 液（10mg/ml）（注：若膠內未加EB，可選用此法）。〕
7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調節穩壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點樣端放陰極端。根據經驗調節電壓使分帶清晰。
8、觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。
9、染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上，放進EB溶液中進行染色，完全浸泡約30min。
10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm或254nm），通過觀察孔進行觀察。
五、注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區域操作，戴一次性手套，并及時更換。
2、預先加入EB時可能使 DNA的泳動速度下降15%左右，而且對不同構型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若膠內或樣品內已加EB，染色步驟可省略；若凝膠放置一段時間后才觀察，即使原來膠內或樣品已加EB，也建議增加此步。
3、加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時清除，否則，需重新制膠。
4、以0.5×TBE作為電泳緩沖液時，溴酚蘭在0.5%～1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動速度大約相當于300bp的線性DNA的泳動速度，而二甲苯青 FF的泳動速度相當于4Kb的雙鏈線形DNA的泳動速度。