DNA的純化濃縮與定量

實驗目的

將復雜的細胞分子混合物加入有機溶媒萃取以除去蛋白質及其它成分，就可以純化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白質變性(denaturaion)的特性來進行萃取的步驟，DNA和RNA不溶于有機溶媒中，而溶于水層。另外，分子選殖(molecular cloning)常利用洋菜膠(agarose)來分離不同大小的DNA片段或用以純化DNA。

核酸定量可利用核酸會吸收260及280 nm波長的UV光，而且可與熒光染劑ethidium bromide (EtBr)鍵結，這些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收來評估DNA的純度，若純化DNA的量足夠時，可用光譜分析法定量，當DNA量少或不純時，才用EtBr鍵結方法。(注意：EtBr為致癌劑，操作時務必帶手套，并禁止戴手套的手到處亂摸!)

溶媒萃取法

1.儀器用具：

(1).桌上型離心機

(2).37℃恒溫箱

(3).排煙柜

2.藥品及試劑：

(1).phenol/chloroform = 1：1

(2).chloroform/isoamylalcohol = 24：1

(3).RNase A：1mg/ml (100 加熱30分鐘去除DNase活性)

(4).100% ethanol

(5).TE buffer

3.方法步驟：

(1)由實驗1中小量制備的DNA樣品，加入RNase A以去除RNA，其終濃度為10-20 mg/ml。

(2)加入50 ml TE buffer混合均勻。

(3)加入100 ml phenol (注意! phenol對皮膚具腐蝕性藥品，務必帶上手套并在排煙柜中操作)，混合均勻使溶液形成混濁狀，這樣可以避免震蕩及攪拌時所產生的拉力將DNA弄斷。

(4)12,000 rpm離心20秒，小心用pipetman把上層液取出到另一離心管。

(5)加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取剛才收集到的上層液，重復步驟4。

(6)加入200 ml chloroform萃取上層液，并重復步驟4。

濃縮質體DNA

1.儀器用具：

(1).桌上型離心機

(2).真空干燥器

2.藥品及試劑：

(1).3 M sodium acetate (NaOAc),pH 5.2

(2).100% ethanol

(3).TE buffer

3.方法步驟:

(1)加入1/10體積的sodium acetate于DNA溶液中，使其最終濃度為0.3 M。

(2)加入2.5倍體積100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分鐘(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，應把溶液放在-70 下2小時，若DNA小于200 bp時，加入10 mM MgCl2 有助于DNA回收。)

(3)12,000 rpm離心10分鐘，倒掉上清液，置于真空干燥器10分鐘。

(4)加50 ml TE buffer or water，再次懸浮DNA，保存樣品DNA于4 。