| 實驗步驟 | 材料與設備
質粒 DNA(含待分離序列特異性 DNA 結合因子的識別位點)
合適的限制酶
粉/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/異戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
牛腸堿性磷酸酶（BoehringtrMannheimCorp.713023)
[γ-32P]ATP(150uCi/ul;7000Ci/mmol;21pmol/ul)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸銨 (2.5mol/L)
乙酸鈉 (3mol/L)
SpeedVac 旋轉濃縮器（Savant Instruments，Inc.)
丙烯酰胺
雙丙烯酰胺
過硫酸銨
TEMED(N,N,N'，N'-四甲基乙二胺）
試劑
TE
牛腸堿性磷酸酶緩沖液（10x)
T4 多核苷酸激酶緩沖液（10x)
TBE 加樣緩沖液（5X)
TBE(10x)
(配方，見“試劑的配制” pp.131~138.)
操作程序
質粒 DNA
用于制備 DNA 酶 I 足跡探針的質粒 DNA 必須是高質量的（CsCl 純化的)，其 RNA 雜質的含量必須很低。RNA 雜質會抑制激酶的反應。我們一般采用連續兩步 CsCl 梯度法純化 DNA。
第一次限制酶切消化
第一次限制酶切消化的目的是形成 5'突出端。酶切位點的位置應在離因子結合位點 50~200bp 范圍內。
1) 質粒 DNA(50ug 的量較方便) 與第一個限制酶一起孵育，用瓊脂糖凝膠電泳監測反應是否完全。
2)DNA 用 1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/異戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至終濃度為 1ug/ul。
去除 5'端的嫌酸
1) 每微克 DNA 中加入 1U 牛腸堿性磷酸酶 [例如，為使 50ugDNA 脫磷酸, 需在 500ul 總體積中加入 50U 磷酸酶（50U=50ul)〕。37°C 孵育 2 h。
2)DNA 用酚、1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/異戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至終濃度為 1ug/ul
注；一個便利的辦法是將大量 (≥50ug)DNA 酶切消化和脫磷酸后作為儲液儲存起來，需要時標記少量 (一般為 5ug)DNA 備用。
標記 5'端
1) 于含 2ul 10xT4 多核苷酸激酶緩沖液的 11ul 水溶液中加入 5ul 經酶切消化和脫磷酸的 DNA(1ug/ul; 總量 5ug;5pmol5'端)，震蕩混合。
2) 對此混合物，加入 1ul[γ-32P]ATP(標記 ATP 與 DNA5'端的摩爾比應為 2~4)，然后加入 1ul T4 多核苷酸激酶（此激酶是過量的)，反應終體積為 20ul。
3)37°C 孵育 1~2 h。
4) 加 200ul 2.5 ml/L 乙酸銨，震蕩混合。微型離心機離心 0.5s, 使溶液回到離心管底部。
5)70°C 加熱 15 min, 使激酶失活。置冰上冷卻。
6) 加 660ul 100% 乙醇，顛倒混合 a 微型離心機離心 15 min, 沉淀 DNA。用吸頭吸去上清。
注：應極小心，不要吸走 DNA 沉淀。并確認沉淀有適量水平的放射性。
7) 加 100ul TE, 震蕩混合，溶解 DNA。
8) 加 100ul 1:1 酚/氯仿，震蕩混合 1 min, 離心 5 min, 使分相。
9) 將上層轉移至一新管，加入 10ul 3 ml/L 乙酸鈉，震蕩混合。
10) 加 300ul 100% 乙醇，顛倒混合。離心 15 min, 沉淀 DNA。用吸頭吸去上清。
注：應極小心，不要吸走 DNA 沉淀。并確認沉淀有適量水平的放射性。
11) 加 800ul 75% 乙醇，顛倒混合。離心 15 min, 沉淀 DNA。用吸頭吸去上清。
注：應極小心，不要吸走 DNA 沉淀，并確認沉淀有適量水平的放射性。
12) 用 SpeedVac 旋轉濃縮器干燥沉淀。
13)DNA 溶于 10ulTE。
第二次限制酶切消化
第二次限制酶切消化的目的是產生 200~800bp 的標記 DNA 片段。
1) 探針 DNA 與第二種限制酶孵育。為保證此反應進行完全，建議盡可能地使用大大過量的酶，如対 5~10ug 的 DNA 甲 50~100U 的限制酶。
注：應注意限制酶的磷酸酶活性。通常用廉價的酶如 EcoRⅠ和 HindⅢ較合適。反應 80ul體積中進行較為方便。如需要，可用瓊脂糖凝膠電泳監測反應的進程。
2) 用 1:1 酚/氯仿抽提 DNA。然后于 80ulDNA 中加入 20ul5xTBE 加樣緩沖液，直接加樣至 5% 聚丙烯酰胺（非變性) 凝膠。
標記限制酶切片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳
1) 按下列配方制備聚丙級酰胺凝膠 (20 cmX40 cmX1.5 mm; 有 4 個 3-cm 加樣孔）：
丙稀酰胺 (30%;w/v)/雙丙插醜胺 (0.8%;w/v)20.3 ml
TBE(10x)12.5 ml
H2092.2 ml
混合后過濾，然后加 750ul 10%(w/v) 過硫酸銨和 60ul TEMED。
2) 凝膠至少聚合 45 min，然后在 19W(約 400V) 下預電泳至少 lh。電泳時膠不應變熱。
3) 加樣，電泳一段所需時間后. 電壓會緩慢地從 400V 增至 450~500V。
注：二甲苯腈藍在 5% 膠上與 300-bp 限制酶切片段一起遷移。
從聚丙烯酰胺凝膠洗脫 DNA
本法用于≤8% 的聚丙烯酰胺凝膠，效果良好
1) 從膠板上切下有放射性的條帶，應盡量減小條帶的大小。
2) 用 18-G 號針（粉紅色）在 l.5-ml 塑料微量離心管底打一小孔。
3) 將有孔的微量離心管底部插入另一 1.5-ml 微量離心管（無孔）中。
4) 將切下的膠塊放入上一個有孔的微量離心管中。
5) 將兩個微量離心管一起放在微型離心機中離心 15s。膠塊通過小孔進入下一個微量離心管時應被破碎。
6) 加 300ul TE, 震蕩混合。
7)37°C 孵育過夜。
8) 用 20-G 號針（黃色）在 1.5-ml 塑料微量離心管底打一小孔。在管底小孔之上填裝約 200ul(裝填結實后的體積) 硅化玻璃棉。硅化玻璃棉應裝填結實于管底。然后，將此管的底部插入另一 1.5-ml微量離心管（無孔）中。用一尖端被刀片切去大約 2~3 mm 的 1000-ul 吸頭（藍色)，將 TE 和破碎膠塊的混合物置于玻璃棉上，將這兩個微量離心管制成的裝置放在微型離心機中離心 10s。下管中應含有 TE 洗脫的 DNA 片段。
9) 乙醇沉淀探針 DNA, 然后溶于 TE。
10)-20°C 保存。 展開 |
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