DNMT3A突變相關白血病發病的分子機制及治療靶點新發現

　　來自上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院、上海血液學研究所的研究人員證實，在小鼠造血系統中條件性敲入DNA甲基轉移酶3A（Dnmt3a）R878H突變基因，可誘發急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML），mTOR通路異常活化可能是潛在的治療靶點。《美國科學院院刊》（PNAS）雜志5月1日上線發表了這一研究成果。陳竺（ZhuChen）院士、陳賽娟（Sai-Juan Chen）院士以及王月英（Yue-Ying Wang）研究員是這篇論文的共同通訊作者。

　　早在2011年，該課題組就發現DNMT3A在急性單核細胞白血病患者中存在高頻突變，并與預后不良相關，為AML的診斷和預后評價提供了一個新的分子標志物。文章在《自然遺傳學》（Nature Genetics）發表。隨后，利用逆轉錄病毒轉導和骨髓移植技術建立了DNMT3AR882H熱點突變的小鼠模型，揭示該突變可影響白血病相關基因的DNA甲基化水平，從而使這些基因表達水平增加，包括Hox家族、Idh1、Hlf、Flt3和Mpl等，最終導致慢性粒單核細胞白血病的發生。這一工作又于2014年《PNAS》雜志發表。

　　近年來該課題組利用胚胎顯微注射技術建立了Dnmt3a R878H（與人類DNMT3AR882H相對應）條件性敲入小鼠模型，進一步研究了在內源性啟動子/增強子的調控下，DNMT3A突變如何導致白血病的發生。結果發現，Dnmt3a突變這一遺傳學改變即可引起小鼠造血干/祖細胞異常增殖并誘發AML，而白血病起源細胞主要是LSK（Lin-Sca1+cKit+）的造血干/祖細胞群體。通過白血病細胞的轉錄組和DNA甲基化譜的研究，以及白血病干/祖細胞的單細胞RNA測序分析，揭示了Dnmt3aR878H突變可引起基因表達和表觀遺傳調控模式的顯著變化，導致造血細胞分化阻滯和增殖過度。研究還發現，Dnmt3a突變可通過DNA低甲基化修飾而使mTOR活化增加，進而上調細胞周期關鍵蛋白CDK1的表達，促進造血細胞增殖。過表達的CDK1則可磷酸化組蛋白甲基化修飾酶EZH2，引起異常的組蛋白H3K27三甲基化譜。根據這些結果，研究人員使用了mTOR的特異性抑制劑“雷帕霉素”，發現該抑制劑可顯著抑制白血病細胞增殖。此外還顯著減輕小鼠的白血病癥狀并延長生存期，提示異常活化的mTOR可作為潛在的藥物作用靶點。因此聯合應用mTOR抑制劑，有望顯著改善DNMT3A突變相關AML患者的治療效果。

　　技術評論

　　近些年來，單細胞分析技術已成為科學研究領域強有力的工具。技術的革新使我們得以追蹤、捕獲單個細胞，從而在單細胞層面開展基因組、轉錄組以及蛋白質水平的研究。為了深入解讀白血病起源細胞的生物學特征，文中利用單細胞RNA測序技術對比了Dnmt3aR878H/WT突變和Dnmt3aWT/WT對照小鼠LSK造血干/祖細胞的基因表達譜。小鼠LSK造血干/祖細胞的單細胞cDNA文庫由FluidigmC1平臺制備（圖1），然后利用IlluminaMiSeq平臺完成測序。比較分析測序結果發現Dnmt3aR878H/WT突變小鼠中細胞周期調控與轉變相關基因的表達水平比Dnmt3aWT/WT對照小鼠具有更高的異質性（圖2）。

圖1捕獲的單細胞在顯微鏡下的成像結果

圖2Dnmt3aR878H/WT突變和Dnmt3aWT/WT對照小鼠LSK造血干/祖細胞的基因表達水平和異質性對比結果

　　此外，研究還發現Meis1, Hlf, Mpl, Hoxa7, Hoxa10和Gata3等與白血病形成相關的基因在Dnmt3aR878H/WT突變小鼠的LSK造血干/祖細胞中上調，與細胞周期、CML（chronicmyeloid leukemia）、mTOR和AML信號通路相關的基因簇過表達。同時，對單細胞轉錄本數據的PCA分析結果表明Dnmt3aR878H/WT突變小鼠的LSK造血干/祖細胞和Dnmt3aWT/WT對照鼠的LSK造血干/祖細胞是不同的群體，進一步說明患病小鼠大部分的LSK細胞具有獨特的轉錄本特征。這些發現有助于闡明白血病起源細胞在疾病發生過程中的進化潛能，并且極大地擴展了我們對急性髓系白血病發病機制的認知。