ELISA實驗中常見問題和注意事項

　　1 臨床標本的收集和保存

　　用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿）。本實驗室用ELISA測定乙肝兩對半，甲肝，戊肝，抗HIV的標本時，在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

　　1）要注意避免出現嚴重溶血及血清中混有紅細胞。當標本出現嚴重溶血及血清中混有紅細胞時，反應孔不易洗凈，殘留在反應孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶的活性，顯色時可能造成假陽性。

　　2）標本凝固不全強行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實驗過程中形成纖維蛋白吸附在反應孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結果。

　　3）血清標本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長時間保存，則需放入-20℃冰柜內冰凍保存。冰凍保存的血清標本須注意避免反復凍融，標本可能引起假陰性結果。此外凍融標本的混勻不要進行劇烈振蕩，應反復顛倒混勻。

　　2 ELISA測定中試劑準備

　　在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，證試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來直接做實驗會造成一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因為在后面的孵育反應步驟中，造成孵育時間不夠。其次，ELISA實驗中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。

　　3 加血清樣本及反應試劑

　　血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點：

　　1）加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時，加樣槍需按到第一檔，加樣時，加樣槍需直接按到底。

　　2）加樣應直接加入反應孔底部，加在反應孔孔壁上易濺出會對鄰近孔產生污染。盡量避免出現氣泡。

　　3）反應試劑的加入時先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出現重復滴加或加在兩孔之間

　　4 溫育的時間與溫度

　　溫育是ELISA測定中最容易出現問題的步驟。溫育溫度應在37℃，水浴。溫育時間應按照試劑說明書上的時間嚴格執行。溫育實際測定操作中要注意以下幾點：

　　1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來。

　　2）因為采用水浴，所以在溫育時一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應孔內造成污染，并有可能整板花板。

　　5 ELISA測定的洗板

　　全自動洗板機的使用應注意以下幾點：

　　1）洗板前，應檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶

　　在自檢過程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3）在洗板過程中，應注意觀察反應孔每孔是否灌滿且無外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時間。

　　6 ELISA測定以TMB為底物的顯色

　　加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定判斷結果。在此過程中應注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則重做實驗。

　　7 ELISA的比色測定

　　ELISA的比色測定由酶標儀進行測定，故需強調比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。

　　8 ELISA測定結果判定

　　結果判定一般是根據比色結果和肉眼觀察綜合判定。如在判定過程發現有些反應孔出現倒陰不陽的現象或出現不常見的模式（如乙肝兩對半中出現12陽性等），需本著嚴謹的態度，重新復查。

　　對ELISA測定中出現問題的可能原因（非試劑盒本身的原因），總結如下：

　　1)弱陽性質控樣本檢測不出溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題。

　　2）測定的重復性差，這是由于測定操作引起的問題，包括

　　①加樣本及試劑量不準；孔間不一致

　　②加樣過快，孔間發生污染

　　③加錯樣本

　　④加樣本及試劑時，加在孔壁

　　⑤不同批號試劑盒中組分混用

　　⑥溫育時間、洗板、顯色時間不一致

　　⑦孔內污染雜物，

　　血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性等。

　　3）全部孔都不顯色

　　①漏加酶結合物；

　　②洗板液配制中出現問題

　　③漏加顯色劑A或B

　　④終止劑當顯色劑使用

　　4）全部板孔均有顯色

　　①板不干凈

　　②顯色液變質

　　③洗板液受酶等污染