| 試劑、試劑盒 | 胃蛋白酶 中性福爾馬林緩沖液 甲酰胺 乙醇 |
|---|---|
| 儀器、耗材 | 探針試劑盒 熒光顯微鏡 |
| 實驗步驟 |
一、切片及制片
1.從福爾馬林固定石蠟包埋的組織塊上切厚組織切片，37°C 水浴展片。
2.貼在正含電荷的載玻片上。
3.另連續切一張相應的組織切片，用蘇木素和伊紅（H&E) 染色（見注釋 2)0
二、脫蠟和浸透組織切片
1.在 HE 切片上確認適當的腫瘤細胞位置（見注釋 3)。
2.檢查切片組織的成分及固定質量（見注釋 4)。
3.烤箱或烤片器中烤片 60°C、2 h(見注釋 5)。
4.將切片放入切片架，二甲苯 3 缸，每缸 5 min，去除石蠟。過 3 遍無水乙醇（見注釋 6)。
5.用烤片器或電熱板 45°C、3 min 干片。
6.將切片放入室溫下 50 mL0.2mol/LHCl 中 20 min。
7.50 ml 蒸餾水洗片 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。
8.放入 81°C 的 lmol/LNaSCN 中，30 min(見注釋 7)。
9.蒸餾水洗 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min(見注釋 8)。
10.37°C 于胃蛋白酶溶液中 3?IOmin(見注釋 4 關于最佳時間的說明）。
11.換新的 50 mL 蒸餾水洗 lmin，50 mL2XSSC 洗 2 次。
12.45°C、3 min 干片。
13.二次固定：室溫下放至 10% 中性福爾馬林緩沖液中，IOmin(見注釋 9)。
14.2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。
15.45°C、3 min 干片（見注釋]_0)。
16.放入 81°C 水浴中的 70% 甲酰胺/30%2XSSC 溶液中 5 min，使組織切片上的 DNA 變性。立刻連續放入 70%、85% 和 100% 乙醇中，每缸 Imin(見注釋 11)。
17.45°C 不超過 2 min 干片。
三、雜交
1.調暗室內燈光。
2.用微量加樣器取 IOpL 探針溶液，呈線狀滴加在蓋玻片上（見注釋 12)。
3.將蓋玻片蓋在組織上，橡皮泥暫時封片。
4.切片放入密閉濕盒（不能有水滴落），37°C、18 h(過夜)。
四、雜交后洗脫
1.設置 71°C 水浴，加熱 50 mL 含 0.3%NP-40 清潔劑的 2XSSC。
2.調暗燈光。
3.從溫箱中取出載玻片，用鑷子剝去橡皮泥，室溫下將載玻片浸入 2XSSC/0.3%NP 中數分鐘（見注釋 13)。
4.將載玻片（一次不超過 4 張）放入加熱（72°C) 的 2XSSC/0.3%NP 中 2 min。
5.取出載玻片，迅速放入室溫的 2XSSC，空氣干燥。
6.向蓋玻片滴加 IOjuLDAPI，將載玻片蓋在蓋玻片上并翻轉（見注釋 14)。
7.用指甲油將蓋玻片的邊封上。
8.將玻片置于密閉的切片盒一 20°C 保存。
9.用顯微鏡觀察前玻片恢復至室溫并擦去多余的水分。
五、分析
1.在明視野顯微鏡的低倍物鏡（10X 或 4X) 下瀏覽 H&E 切片，找到想要研究的腫瘤細胞集中的區域（見注釋 15)。
2.從不同視野中數 60 個腫瘤細胞（見注釋 16)。
3.記下每個腫瘤細胞的紅綠信號（見注釋 17?20)。
注釋
1我們曾用 20 年的蠟塊成功地進行了 FISH。
2.組織切片須由技術嫻熟者用薄片切片機操作，始終保持切片方向一致。
3.此步應在病理醫師指導下進行。應核對組織樣本以確定包含適當的浸潤性腫瘤細胞。只有浸潤性乳腺癌細胞可以計數。浸潤性腫瘤細胞必須與出現在同一切片上的導管原位癌細胞、淋巴細胞、組織細胞、間質纖維細胞或脂肪細胞區別開來。如果你的計數包括 2/2 計數細胞或擴增的細胞，應再次檢查以確定在計數腫瘤細胞時沒有將正常的組織細胞（尤其是滲出的淋巴細胞）計入。
在低倍鏡下掃描組織切片并標出腫瘤細胞區和標志物，有利于下一步定位 HSH 切片。標志物包括血管、脂肪組織區、正常導管區和 DCIS 區。分析 FISH 切片時要注意腫瘤內的異質性。注意任何不當的固定或組織變形（尤其當切片是冰凍切片時）都可能干擾判讀。我們認為可以在 H&E 切片的蓋玻片上用 Sharpie?marker 筆畫出腫瘤區域以供參考。
4.蛋白酶處理的最佳時間取決于蠟塊的年限，需要在進行 HSH 準備工作前了解組織成分和組織固定的質量。粗針穿刺的標本、含腫瘤細胞較少的切片和有大塊壞死區域的組織要降低蛋白酶作用的時間。這些樣本需要慎重對待以免過度消化。
5.同時，向染缸加入 50 mLlmol/LNaSCN 并放入水浴箱，將溫度調至 81。。。
6.此步應在通風櫥中進行。這些溶液可用于許多載玻片并使用幾個月直至變臟才更換。
7.同時向染缸加入 50 mL0.2mol/L HCl 并放人 37°C 水浴，解凍一個包裝的胃蛋白酶，于 O.2mol/L HC1 中混勻。準備下列物品備用：混合 35 mL 甲酰胺和 15 mL2XSSC，70%、85% 及 100% 乙醇各 50 mL。
8.取出切片后，關掉水浴，直到染缸內的 70% 甲酰胺、30%2XSSC 為 71℃。
9.從長期儲存的蠟塊制備的切片（手術后 2?3 年以上）如果未進行第二次福爾馬林固定，信號會較明亮。
10.取出探針解凍，并確保 H&E 切片在旁邊以供參考。
11.如果使用 HyBritechamber(VYSIS30-144010)，跳過 16 步和 17 步。
12.將蓋玻片放在潔凈的棕色紙巾上置于工作臺.（醒目），手持載玻片，以組織切片的目標區域朝向探針，緩慢靠近直至接觸到探針液體，迅速拿起并翻轉載玻片，使蓋玻片緊貼載玻片。探針溶液應在蓋玻片下迅速擴散不形成氣泡。用永久記號筆在載玻片上于蓋玻片的上下角處畫細線標記。
13.蓋玻片應在液體中滑脫或用鑷子輕柔地揭去。這時的組織非常脆弱要注意不能刮傷。
14.對較小的腫瘤細胞區域我們使用 5PL 探針及 18 mm 蓋玻片。VWRScientific，目錄號 48380046。
15.找到任一標記物，然后轉到 25 倍物鏡。用熒光顯微鏡在 H&E 切片上找到目標區域并注意這些標記物的位置，在熒光光源下的形態特征。帶著這個印象再在 25 倍物鏡下觀察 FISH 切片，并找到細胞的位置。找到腫瘤細胞的區域并記住周圍組織結構的特征。換 100倍物鏡及油鏡觀察同一視野。腫瘤細胞中應不混有結締組織，但仍像 H&E 切片所示成簇緊密排列。
16.用三色濾光片（橙/綠/DAPI 藍）可以看到細胞核完全藍染，探針呈明亮的橙色光點，而 CEP17 探針呈綠色光點。為確定雜交過程正確與否可用 2/2 計數分析一些間質細胞或鄰近的淋巴細胞核。尋找不重疊而且信號明亮、分散的腫瘤細胞。尋找有兩個綠色信號的細胞并計數相應的紅色信號。
17.過度消化會導致腫瘤細胞離散或呈粗糙團塊狀，失去周圍組織，如果出現這種情況，重復實驗時要減少蛋白酶消化時間。固定過程不佳會導致「空心細胞」，組織結構雖然完整但是 DAPI 顯色時會呈現黑色暗區。即使重復實驗過程也不能彌補，只能仔細復習切片，在其他蠟塊尋找保存最好的區域進行 FISH。
估計載玻片制備的技術質量，并以此來評價樣本是真正的單體性或多體性，還是應該重復實驗。
18.通過單通道濾光片可以看見非常弱的信號，也就是用三色濾光片持續觀察特定的細胞核，依次換黃色及綠色濾光片以確定在用三色濾光片下較弱的信號。
19.如果 HE 切片或 IHC 染色切片顯示組織有異質性，從每個區域選取 20 個細胞進行進一步分析。我們及其他研究者（Ridofi 等）已發表文章說明 DCIS 和浸潤性腫瘤成分的實驗結果是不同的（圖 1E)。
20.建議使用 Vysis 探針試劑盒收集每個細胞的紅綠熒光信號信息。通過記錄單個細胞可以評價異質性的程度和在樣本中計數的分布。當所有數據以平均數形式給出時單個細胞的信息就不能體現。當評價低度或臨界性擴增的病例時，這些信息就顯得十分重要。
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