HIV檢測：更新版

學習目的：
1、了解CDC最新的HIV檢測推薦清單
2、描述HIV的病原學
3、列舉并解釋不同的HIV篩查試驗的方法學
4、列舉急性HIV感染患者的常見癥狀
5、定義NAAT并解釋使用的時機
6、確定并解釋快速HIV抗體檢測的方法學
7、列舉尿液HIV檢測的優缺點
8、討論家用HIV檢測的優劣
9、解釋HIV確認試驗結果的含義

   自1985年第一個HIV診斷試劑問世以來，HIV的檢測已經變得越來越簡便、靈敏、更具操作性以及更少侵入性。不幸的是，全國的數據顯示，大部分新的人免疫缺陷病毒（HIV）診斷試劑針對的都是疾病的晚期。在美國，有40%的新近診斷為HIV感染的病人會在一年內發展成艾滋病。

此外，美國大約還有1/4的HIV攜帶者并不知道他們已經被感染了，以至于錯失了能夠拯救生命的抗病毒治療的時機。從公共衛生的角度講，缺乏對HIV感染的認識是導致上述情況的關鍵；據估計有半數以上通過性途徑感染了HIV的患者就是源于缺乏對HIV的警惕所致。

數據顯示只要人們對于HIV感染有著清醒的認識，就會減少很多高危行為，從而降低傳播感染的可能性。HIV檢測提供了一個減少HIV感染持續傳播的機會，并給新病人挽救生命的治療提供了幫助。

   為了提高人們對HIV感染的認知度，美國CDC在2006年擴大了其HIV測試的推薦范圍。新的CDC推薦在醫療衛生機構內鼓勵所有成年人自愿進行HIV篩查，取代了傳統的僅針對“高危”病人進行篩查的做法。

推薦同樣建議取消HIV測試所要求的書面同意書、高危人士的年度復檢以及妊娠初期HIV檢測陰性的婦女第三個月篩查的做法。本文著重對現有HIV測試的類型、不同類型檢測在公共衛生和臨床領域中所起到的作用等進行了述評。此外對新的測試模式及策略，特別是快速診斷和核酸擴增試驗（NAAT）也進行了回顧。

   HIV病原學及自然史

人們對HIV傳播動力學和感染后臨床過程理解的增加改變了HIV檢測策略。HIV是一種逆轉錄病毒，含一個包膜和一個病毒核心。病毒的包膜是在病毒萌芽期間取自人細胞膜而成，并攜帶有Env病毒蛋白。Env含有糖蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。

包膜內的病毒衣殼由數千個另一種病毒蛋白（p24）組成。由于這三種蛋白均具有高抗原決定性，因而被用于許多HIV診斷試劑盒中。衣殼包圍著兩條HIV單鏈及RNA，每一條單鏈RNA都含有病毒的九個基因。

   HIV是人類病原體中最具變異性的一種。在美國，大部病例都是由HIV-1型所致。而HIV-2——相似卻不同的病毒，在非洲西部一些地區的艾滋病患者中很常見，但在美國卻很罕見。1998年CDC報告美國的HIV-2感染者只有79例。而與此同時，有越來越多的HIV-1變異株得到了確認并被進行了分類。雖然世界上大部分HIV感染者的感染株都是HIV-1M株，但全球HIV的分布卻是復雜多變的，不同毒株的流行情況時刻都在變化著。HIV-1 O群主要分布在喀麥隆，在美國并不常見，第一例在美國被報道的HIV-1 O群感染者出現在1996年。

   感染的宿主以及病毒標志物已經被用于診斷，但它們在HIV感染的發展過程中會不停地改變著。在HIV感染的最初幾天中，病毒會開始活躍復制，這使得病毒RNA的檢測成為可能。不久之后可以檢測病毒抗原（蛋白）。

在HIV診斷中檢測最多的是衣殼蛋白p24，這一般會在急性感染后的兩到三個星期內出現。p24在血清中出現的時間較為短暫，會隨著體液和細胞免疫的發展而消失。通常最先出現的抗體是抗衣殼或包膜蛋白IgM抗體，但存在時間較短，隨后出現的是IgG抗體。

IgG抗體針對的是核（p24）以及包膜（gp160、120、41）蛋白，跟隨其后的是抗HIV病毒酶的抗體。抗不同HIV蛋白的可檢測抗體的發展過程被稱為HIV血清轉移，標志著所謂“窗口期”的結束。HIV急性感染期通常指的是從感染了HIV到血清轉換的這一過程。

   緊隨HIV急性感染之后的是一段可能長達10年或以上的臨床潛伏期。在這段期間，病毒的復制會保持活躍，這將導致免疫系統的持久激活和后續CD4 T細胞計數的進行性降低。病毒和宿主兩方面的因素都能決定CD4 T細胞計數減少的速率，最終導致的結果是免疫功能喪失和增加機會性感染的可能性。

   HIV檢測技術

HIV檢測可以分為篩查或確認試驗。標準的檢測程序是先做一個篩查試驗，如果出現陽性結果則再進行一個確認試驗。不論使用什么類型的篩查方法，一份出現了陽性結果的樣品都應該采用相同或不同的篩查試驗再次進行測試。如果該樣品重復檢測結果仍為陽性，則應進行確認試驗。

包括傳統檢測（酶聯免疫測試）和快速檢測在內的篩查試驗對血清抗體的檢測都具有很高的靈敏度，因而很少會出現假陰性結果。確認試驗主要包括有免疫印跡（WB）、間接免疫熒光抗體檢測（IFA）和新近推出的通過NAAT檢測HIV RNA。所有這些測試方法都具有很高的特異性，這意味著出現假陽性結果的可能性很低。

   篩查技術

酶聯免疫（EIA）

酶聯免疫（EIA）是最常用的篩查方法。該方法操作簡便，適合于大量樣品的測試，同時也具有較高的靈敏度和特異性。目前絕大多數的EIA檢測試劑都已通過FDA認證，可以用于血清、血漿、末梢血、唾液和尿液樣品的篩查。

EIA檢測試劑采用包被有HIV抗原的微孔板來檢測樣品中的HIV抗體。EIA產品已經歷經四代（見表1），最新的一代已經改進了檢測性能，縮短了無法檢測抗體的窗口期。第一、二代EIA試劑的窗口期大約為6-12個星期，檢測的均是抗HIV IgG抗體。

第一代EIA試劑采用的是HIV病毒溶解物作為靶抗原，而第二代采用的是代表HIV衣殼和包膜的重組蛋白。目前在美國市場應用最多的用于HIV篩查的仍是第二代EIA試劑。

第三代產品除檢測IgG抗體為還能檢測IgM抗體。它采用的是“雙抗原夾心法”，其中一個抗原包背于固相，另一個抗原與諸如堿性磷酸酶或辣根過氧化酶等結合。另外，第三代EIA試劑還具有檢測特定HIV亞型的能力，比如前兩代產品所不能檢出的HIV-10群或HIV-2。

   第四代產品除了能夠檢測IgM或IgG抗體外，還能檢出病毒衣殼抗原p24的存在。檢測p24抗原可以將窗口期縮短至兩周，并使得急性HIV感染（即血清轉換前的HIV感染）的檢測成為可能。目前已有8家第四代商品化產品，但尚無一家通過FDA的批準。

第四代產品將抗原和抗體檢測結合在同一個測試中。新近針對第四代產品的研究對比了不同檢測試劑的靈敏度和窗口期，最后聚集的是最新推出的第四代產品：VIDAS HIV DUO Ultra。

   與其他第四代產品不同的是，VIDAS HIV DUO Ultra試劑可以針對抗原與抗體檢測給出兩個清晰的結果，對于p24抗原的最低檢出限值為3pg/mL。這些特性使得急性HIV感染和/或既往感染的區分變得可能。

該產品用于包被聯合抗原-抗體的微孔板的設計很是與眾不同，微孔的上部包被有抗-p24單克隆抗體，孔的下部包被有用以檢測IgG、IgM和針對HIV-1和2的IgA的抗原。

HIV DUO Ultra試劑是第四代產品中靈敏度最高的一個（與Enzygnost HIV Intergral、Enzymun HIV Combi、Genscreen Plus HIV Ag-Ab和AxSYM HIV Ag/Ab Combo比較），其靈敏度可以媲美單一p24檢測試劑（Genetic Systems HIV-1 Ag EIA），因而可以作為p24檢測的一個選擇。

   急性HIV感染的篩查測試 核酸擴增檢測和第四代EIA產品

   由于急性HIV感染者的臨床表現總是不明顯或缺乏，因而常常會漏診。而臨床上使用的標準HIV檢測試劑，特別是發展中國家采用的第一代產品和美國所采用的第二代產品是不能確定急性感染病人的。當然急性HIV感染的癥狀、診斷和管理都超出了本文涉及的范圍，故本文不再詳述。

在急性感染后的兩個星期左右，大約2/3的患者會出現逆轉錄病毒綜合癥的癥狀；其中最常見的癥狀是發熱（80%-90%的患者會出現這一癥狀）、身體不適、厭食、肌肉酸痛和頭痛（大約50%的患者會出現）。

雖然仍舊存有爭議，但是現有的臨床數據顯示在血清轉換之前進行治療在短期內是對患者有益的，長期來看通過增加宿主免疫力有可能停止或推遲持續抗逆轉錄病毒治療的需要。從公共衛生這一立場來看，急性HIV感染的確定也是非常重要的。

高水平的病毒血癥加上缺乏對于感染的認識會使急性感染的個體成為高危險傳播者。有典型的示例說明急性HIV感染者是流行的重要傳播者，而流行病學研究也顯示急性感染者比慢性感染者更具傳染性。

   為了能診斷出急性HIV感染，就必須能檢測出病人體內那些出現于血清轉換前的HIV抗原。因此診斷急性感染的金標準是對HIV抗體檢測陰性者進行NAAT測試。NAAT檢測既能定性又能定量。定量測試能確定血漿中的病毒載量、監控疾病的進展和對抗病毒治療的反應。

另一方面，定性檢測揭示了HIV RNA的存在與否，用于篩查樣品中HIV抗原的存在。APTIMA HIV 1 RNA Qualitative Assay（美國Gen-Probe公司產品）是目前唯一通過FDA認證的NAAT產品，可用于（1）HIV-1感染的診斷；（2）當HIV-1抗體檢測為陽性時，確認HIV-1感染。

   由于價格高、費時和技術要求較高，所以NAAT產品并不包括在HIV常規篩查項目內。為了縮減費用，美國對獻血者采用了對混合標本進行NAAT測試的方法。其做法是將所有抗體檢測為陰性的樣品按一定數量混合為一組，對每一組分別進行NAAT測試。

測試結果為陰性的結束篩查；如果有一組NAAT檢測結果為陽性，那么就要對該組進行拆分檢測或對每個樣品單獨進行檢測，直至陽性樣品被最終確定。與一個個樣品單獨檢測相比，樣品混合檢測的最大好處就是大大降低了檢測成本。

但是這樣做有一個很大的缺點，那就是樣品的混合其實也是對一個樣品進行了稀釋，這樣一來勢必會影響到測試的靈敏度。最近，公共衛生機構已經開始在某些地方試行將采用NAAT檢測混合樣品的做法列為常規HIV感染的篩查手段。

   如今，特別是在傳統的高危人群地區，將混合樣品NAAT檢測作為常規測試手段的做法已備受人們推崇。目前在美國洛杉磯、舊金山、北卡羅來納、紐約、馬里蘭、華盛頓、佛羅里達以及西雅圖等地的HIV公共測試點正使用這種方法。

在舊金山的公共STD醫療機構中，使用NAAT進行HIV急性感染常規篩查顯示HIV感染者的檢出率增加了8.8%；北卡羅來納州的數據顯示檢出率增加了3.9%。北卡羅來納州和其他一些地方針對這種混合樣品檢測技術的研究表明，社區篩查中采用這種方法的性價比非常高。在北卡羅來納州，每個樣品的檢測費用僅多花了3.63美元。

   如今，樣品混合檢測在樣品混合的總數量、拆分樣品的數量和核酸擴增試驗的使用類型方面都已有所不同。目前用于混合樣品檢測的NAAT試驗的性能對比數據還很有限，但是看起來具有低檢出限值的試驗表現的更為良好。接下來要做的研究是對用于混合樣品檢測的不同NAAT試驗的性能比較進行評估分析。

   雖然NAAT檢測很有前景，但在常規檢測地點采用什么樣的方法才是檢測HIV的最佳途徑還需進一步明確。到目前為止，NAAT已被列入高危人群的篩查方法中。但是在HIV低危區域，NAAT的性價比、陰陽性預測值等還是未知數。

在一定的區域，第三代或第四代EIA產品可能成為NAAT的替代品。雖然在明確急性HIV感染者的數量上第三或第四代EIA產品低于NAAT，但它們還是可以用來確定一些急性感染者的。舉例來說，2003年在西雅圖，通過采用NAAT方法，用于急性HIV感染的HIV-RNA篩查試驗診斷出7例急性HIV感染。

其中四份樣品進行了復檢，這四份樣品中的兩份通過第三代EIA試劑檢測后為陽性。一項在馬拉維進行的前瞻性研究發現，在NAAT確定的HIV病例中，大約有90%都能通過快速檢測試劑和p24抗原檢測試劑測出。由此看來在低收入地區，第三和第四代EIA產品很有希望作為急性HIV感染檢測的替代方法。當然在這些地區，可行的話還是推薦先做一個標準的EIA檢測，然后進行混合樣品NAAT篩查。

   快速HIV抗體檢測

標準EIA檢測的一個缺點在于病人大約需要兩個星期才能得到結果，許多在公立檢測機構進行測試的病人并不會回去拿他們的檢測報告。缺乏對檢測結果的隨訪是一個嚴重的問題，這一問題在那些測試為陽性或是可能已經接觸了HIV的人群中的發生率最高。

而快速HIV檢測試劑由于其檢測過程只需要不到30分鐘的時間，因而檢測結果在當天即可獲得；同時快速檢測可在診所或非常規檢測場所諸如急診室、社區中心等場所進行，因而使用非常方便。總的來說，快速檢測與傳統的EIA相比較更受病人的歡迎，并且也更容易拿到他們的檢測結果——尤其是在一些非常規場合，如公共浴室等處。

   目前已有四種HIV-1/2快速診斷試劑通過了FDA認證，其中一種是可以用于唾液樣品檢測的OraQuick Advance Rapid HIV-1/2抗體檢測試劑。這些試劑的靈敏度也已與標準第二代EIA產品做過比較。

每種快速檢測試劑都在其膜上都包被有合成抗原（HIV-1的gp41和HIV-2的gp36），檢測時可將樣品（末梢血、靜脈血或唾液）加在膜上。如果樣品中含有抗gp41的抗體，那么膜就會改變顏色。另外，每種檢測試劑都采用羊抗人IgG抗體作為質控，每種試劑也都需要定期采用外部質控品進行檢查。

   每種快速檢測試劑依照臨床實驗室改進修正案（CLIA‘98）的要求規定了操作人員和檢測機構的類型。

沒有受過正規實驗室培訓和在傳統實驗室以外進行操作的人可使用獲得批準的試劑，這類檢測試劑必須能夠直接采用未經處理的樣品（如唾液或全血），并且能夠易于讓那些未經過正規實驗室訓練的人操作。目前快速檢測試劑是唯一可以在實驗室外進行操作的HIV檢測試劑。

   快速檢測試劑的另一個優勢在于它的非侵入性，比如2004年FDA批準的唾液HIV快速檢測試劑。采用全血或唾液樣品檢測HIV1/2 抗體的OraQuick Advance Rapid HIV1/2試劑的后期市場調查顯示出良好的結果。

對超過135,000全血樣品和超過26,000唾液樣品進行的檢測結果表明，全血樣品的特異性為99.98%，陽性預測值為99.24%；唾液樣品的特異性為99.89%，陽性預測值為90%。雖然唾液樣品的特異性稍遜于全血樣品，但專家們并不想勸阻人們不要使用，這是因為該產品在非侵入性上的優勢足以彌補其在特異性上的略微不足。

   雖然有關快速HIV檢測試劑的數據令人鼓舞，但在使用時仍有一些地方值得我們小心。Steckler等人報告了三起OraQuick Rapid HIV-1/2抗體檢測試劑漏檢的早期HIV感染者，這三例病人均由隨后進行的第三代EIA試劑和免疫印跡（Western Blots）所證實為HIV抗體陽性。

雖然這些案例可能是由于操作者的失誤所引起，但這些發現提示在高危人群中進行RNA樣品混合測試是很有意義的。假陰性結果的報告也同時強調了對于陰性結果進行正確判斷的重要性。

   有待商榷和發展：尿液測試

尿液HIV檢測能夠檢測出尿液樣品中完整的HIV IgG抗體，并且該類產品已經通過FDA批準可以與EIA與Western Blot一起使用。由于尿液檢測試劑的方便性和無侵入性，加之尿液可以在室溫下較長期地貯存，因而采用尿液作為樣品進行檢測有助于HIV檢測的進一步推廣。

盡管尿液HIV檢測擁有那么多優勢，其表現也與血液檢測產品相差無幾（一項研究顯示尿液HIV檢測的靈敏度達到98.7%），但目前基于尿液的HIV檢測試劑卻并不常用。

   快速尿液HIV檢測試劑雖然已經商品化，但尚未得到FDA的批準。Aware-Urine試劑（Calypte Biomedical公司產品）最初檢測結果顯示很有前途，但最近在烏干達鄉村進行的研究發現其靈敏度較低。該研究表明，與采用WB確認的血清樣品進行檢測的EIA相比，942份尿液樣品的靈敏度和特異性分別為88.7%和99.9%。

   家用HIV測試

家用快速HIV檢測試劑對于提高HIV檢測的使用量具有潛在的好處，但其在公共衛生等專業機構中能起到什么作用現在還不清楚。家用檢測試劑的好處在于能夠有效的保護隱私以及操作方便——比如不用去公立HIV檢測機構或醫療機構進行檢測。

迄今FDA還沒有批準任何一種完整的HIV家用檢測試劑盒；然而在1999年，FDA批準了第一個HIV家用樣品收集品——Home Access HIV-1 Test System。使用該收集器可以使人們通過郵寄的方式將在家采集的末梢血樣品寄給專業檢測機構，三天以后可以通過電話查詢結果。

   2006年，FDA對一種完整的快速HIV家用檢測試劑——OraQuick ADVANCE 1/2進行了復審。該試劑可以用末梢血或唾液作為樣品進行測試。當樣品被加入測試裝置后，將裝置放入試劑管。測試結果可在20-40分鐘內得到。

   雖然家用檢測試劑的優勢是那么的引人注目，但是仍然存在著許多顯著的問題。目前最關注的問題在于價格；舉例來說，實驗室需要為每個OraQuick試劑支付12-17美元，而在零售藥房，價格可能會更高。

過高的價格可能會使該類產品在高危人群中的普及使用成為一個問題，也可能阻止大眾對其的接受程度。另外，在一些公立HIV檢測機構，OraQuick快速檢測試劑無法解釋的高假陽性率也使得人們高度關注其可能會在家用測試中引發的潛在的假陽性結果。另外一些有關家用HIV檢測試劑的問題還包括：

1）家用HIV檢測試劑是否能擴展檢測的途徑？

2）客戶能否正確的使用它？

3）家用HIV檢測的使用者由于無法得到與醫務人員面談的機會，是否會引發潛在的危害？

4）如何保證家用樣品收集器不影響公共衛生機構的操作？正是由于還存在著許多未知數，所以FDA要求OraQuick的制造商能證明其裝置能被外行人正確操作。目前，Ⅱ期審查正在進行中。

HIV確認試驗

所有的HIV陽性篩查結果都必須由確認試驗進行確認。確認試驗包括WB、間接熒光免疫抗體測試（IFA）和新近推出的已被FDA批準的核酸擴增試驗——APTIMAHIV 1 RNA Qualitative試劑。

確認試驗與篩查檢測相比具有高度的特異性，但也更為耗時以及價格較高。IFA由于其價格昂貴且對操作人員的技術要求較高而很少被使用。WB是傳統的確認試驗，基于識別主要的HIV蛋白（p24、gp41和gp120/160）；改良后的WB可以確定并區別HIV-1和HIV-2型感染。

WB試驗原理為單個HIV蛋白由于分子量的不同可通過電泳分離，然后被轉移至硝酸纖維膜上。

將病人的血清加于膜上，如果存在抗體，它們就會與對應的抗原相結合。CDC指南是這樣定義一個WB陽性結果的，即至少與主要抗原中的兩個反應；而陰性結果是所有條帶皆不出。如果反應結果介于陽性與陰性標準之間，則視為不確定結果。

   在EIA陽性檢測結果中大約會有10%—20%的不確定結果，而臨床上應考慮的是這類結果的危險因素和病人的醫療狀況。某些不確定結果很可能是真的感染者，比如與p24、p31和p55有反應，但p17卻似乎是真的陰性結果。

不確定結果可以是由高水平的非特異性及有交叉反應的抗體所引起的非特異性反應。在使用確認試驗時，假陽性結果很少會出現，當然也不能完全排除存在的可能。假陽性結果可能會出現在伴有自身免疫性疾病的病人身上。對于不確定結果進行復檢的時間一般是在2周到6個月的范圍內。

   結論

自HIV肆虐25年以來，在病原學、免疫學以及HIV感染的治療上都取得了長足的進展。與這些進展同時發展的是不同的HIV檢測技術。自第一個HIV檢測試劑問世以來，新的技術的不斷發展增加了測試的靈敏度和特異性——縮短窗口期——使HIV感染能夠更早地被檢測出——通過更快速和無侵入性的檢測使測試變得更為方便。

未來在快速尿液檢測和采用唾液以及末梢血進行的快速RNA檢測方面還有很大的改進空間。HIV檢測、公共衛生和臨床治療是緊密相連的；現在所面臨的最大挑戰就是如何將這三者全面的聯系起來，從而使得對HIV的控制和治療取得更大的進展。

參考文獻（略）

作者簡介：Carina Marquez，美國舊金山加州大學醫學院博士生；Nicola M.Zetola,MD，加州大學醫學院感染科醫生；Jeffrey D.Klausner,MD,MPH,加州大學醫學院助教，舊金山公共衛生署STD預防與控制處副主任。