HeLa細胞核提取物的SephacrylS300HR柱層析實驗

HeLa 細胞核提取物Sephacryl S-300 HR液氮TM 緩沖液+0.1mol LKCl

XK26 40 柱

材料與設備

HeLa 細胞核提取物（從 12L 細胞培養物制得，見 pp.9l~93)(5-ml 樣品)

XK26/40 柱（PharmaciaBiotech，Inc.)

Sephacryl S-300 HR(PharmaciaBiotech,Inc,)

液氮

試劑

TM 緩沖液+0.1mol/LKCl

(配方，見"試劑的配制"，pp.131~138)

操作程序

所有操作均在 4℃ 下進行。

1) 取 5-mlHeLa 細胞核提取物樣品（從 12L 細胞培養物制得進行凝膠過濾層析, 留取 50ul 提取物供隨后的測活分析用。

2) 對 XK26/40 柱，采用下列柱參數：

直徑=2.6 cm

柱長=34 cm

體積=180 ml

流速=100 ml/h

緩沖液=TM 緩沖液+0.1mol/LKCl

3) 于 S-300 柱加 5-mlHeLa 細胞核提取物樣品。分部收集 5-ml 組分。
注：凝膠過濾層析的關鍵一歩是樣品進入填料床。樣品必須以薄而均勻的圓盤狀進入凝膠。在柱的底部填料是裝填得最均勻也最致密的。因此，有些研究工作者喜歡在使用前將柱子倒置，然后從柱的頂端裝柱時此端為柱的底部加樣。另一種辦法不是將柱子置，而是從柱的底部加樣，使樣品上行，這也是可行的。這兩個方法都是將樣品加在柱中填料最致密最均勻的一端。還應注意，為達到層析的高分辨率，組分的大小應取得小些，一般約為上樣體積的一半。



4) 從 S-300 柱洗脫所得的各組分留取 50-ul 等分試樣，供 DNA 酶 I 足跡分析實驗用。轉錄因子 AP-1 會在 Ve/V0 值約為 1.3~1.35 處洗脫下來。其他許多轉錄因子如 Spl、NF-I/CTF 和 AP-2 等則會在 Ve/V0 值約為 1.35~1.40 處洗脫下來（典型的 S-300 柱的洗脫圖，見圖 2-2,p.95)。

5) 各組分如在 24 小時之內使用，可儲存于 4℃; 若長期保存，則需液氮冷凍，并儲存于-80℃ 下。
注：蛋白質溶液的凍融是蛋白質化學研究能否獲得成功的重要環節之一。對此有多種方法可供選擇。作者建議，蛋白質樣品應盡快浸入液氮冷凍（干冰/乙醇也能滿足要求。但作者不推薦直接將蛋白質樣品放入--80℃ 冰箱。此外，最重要的是冷凍的蛋掃質樣品應盡快解凍。蛋白質活性的丟失常常是由于解凍造成的，與冷凍過程相反，解凍的過程往往很饅。作者建議，將冷凍的蛋白質樣品沒泡在室溫的水中，以盡快解凍，另外，為了加快解凍過程，清除所有在容器周圍可能形成的冰也很重要。

6) 用 DNA 酶 I 足跡法測定各組分中的 AP-1 的 DNA 結合活性（樣品結果，見圖 2-3,p.99)。

7) 含 AP-1 活性峰的 S-300 柱組分可直接上序列特異性 DNA 親和層析柱（見實驗 3)。