NatBiotechnol：利用包膜遞送工具可實現在體內對T細胞進行基因編輯

　　目前大多數獲批的基因療法，包括涉及CRISPR-Cas9的基因療法，都是對體內取出的細胞在體外進行基因編輯，然后將這些經過編輯的細胞輸注回到患者體內。

　　這種技術非常適合靶向血細胞，目前新批準的治療鐮狀細胞性貧血等血液疾病的CRISPR基因療法就采用了這種方法，即在化療破壞了患者的骨髓后，將經過基因編輯的血細胞重新注入患者體內。

　　如今，在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員開發了一種新的CRISPR-Cas9精準靶向遞送方法，能在患者體內對非常特定的細胞亞群進行基因編輯，這是朝著無需在給患者注射經過基因編輯的血細胞之前破壞他們的骨髓和免疫系統的可編程遞送方法邁出的一步。相關研究結果于2024年1月11日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“In vivo human T cell engineering with enveloped delivery vehicles”。

　　CRISPR-Cas9基因組編輯技術的共同發明人Jennifer Doudna在加州大學伯克利分校的實驗室里開發出了這種遞送方法，它將Cas9編輯蛋白和向導RNA（gRNA）包裹在一種裝飾有單克隆抗體片段的膜泡中，而這些單克隆抗體片段片段能夠靶向特定類型的血細胞。

　　Doudna實驗室的CRISPR研究員Jennifer Hamilton通過靶向免疫系統的一種細胞——T細胞進行了驗證，其中T細胞是一種革命性癌癥療法——嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法的起點。

　　Hamilton和她的同事們對配備了人源化免疫系統的活體小鼠進行了治療，將它們的人類T細胞轉化為CAR-T細胞，使其能夠靶向消除另一類免疫細胞——B細胞。

　　Hamilton說，這一壯舉是一個原理上的證明，顯示了使用這種載體方法，包膜遞送工具來靶向和編輯活體動物（體內）的血細胞和可能的其他類型細胞的潛力，以及最終也能用于人類的潛力。

　　Hamilton說，“我們的方法涉及靶向分子的復用，也就是說，在我們的膜泡上有兩種或更多的靶向分子，它們與靶細胞的相互作用有點像計算機中的與門”，即指的是只有當兩個事件同時發生時才起作用的邏輯電路。

　　圖片來自Nature Biotechnology, 2024, doi:10.1038/s41587-023-02085-z

　　“當膜泡使用兩種抗體配體相互作用結合時，我們能夠獲得更有效的遞送。在用T細胞靶向載體治療小鼠后，我們在我們感興趣的細胞類型T細胞而不是肝細胞中觀察到基因組編輯。”

　　她說，高度特異性靶向對于所有向細胞遞送基因的方法來說都很困難。特別是肝細胞，它們經常會攝取遞送到其他地方的遞送工具。

　　病毒包膜

　　Hamilton和她的團隊正在研究幾種遞送基因療法的實驗技術之一。其中許多技術使用有包膜病毒的外殼---將病毒掏空，并填充校正性轉基因或者基因編輯工具，如CRISPR-Cas9。其他方法依賴于直接向小鼠體內注射穿透細胞的Cas9蛋白來實現基因組編輯。

　　Hamilton在攻讀博士學位時研究的是流感病毒等有包膜病毒，她的研究重點是對這類病毒進行基因改造，因為它們有更靈活的外殼。

　　在2021年的一篇論文中，她證實了HIV-1病毒的外包膜被掏空并填充了Cas9后，可以編輯體外培養的T細胞并將其轉化為CAR-T細胞。從那時起，她對病毒包膜進行了很大的改變，如今她把它們稱為包膜遞送工具（enveloped delivery vehicle, EDV）。

　　EDV 的一個重要方面是，它們的外包膜可以很容易地裝飾上多個抗體片段或靶向配體，從而大大提高了靶向特異性。事實已證實，腺相關病毒和脂質納米顆粒等其他基因遞送載體較難實現精確靶向。

　　Hamilton說，“人們正在努力對所有這些載體進行重新靶向，使其對一種細胞類型具有特異性，并防止向其他細胞類型遞送基因。你可以展示抗體或抗體片段，就像我們一直在做的那樣，但旁觀者細胞的攝取率仍然很高。你可以偏向于向一種細胞類型進行遞送，但你仍然可以觀察到旁觀者細胞的攝取。在我們的論文中，我們實際上觀察了肝臟，看看是否有脫靶的情況，結果沒有。我認為，用更傳統的非包膜病毒載體或脂質納米顆粒來實現這一點更具挑戰性。”

　　在這篇論文中，Hamilton和她的同事試圖在體內復制一種成功用于癌癥患者的體外CRISPR CAR-T細胞療法。該療法不僅遞送編碼一種靶向癌細胞的受體的轉基因，還利用CRISPR技術敲除了不靶向癌癥的受體。

　　這些作者成功地敲除了天然的T細胞受體，并遞送編碼一種靶向B細胞的受體的轉基因。由于Cas9蛋白與轉基因是在同一個EDV中遞送的，因此與遞送Cas9基因的方法相比，它的壽命更短，這意味著脫靶編輯更少。

　　Hamilton說，“在這篇論文中，我們試圖實現的是跳過在體外對細胞進行基因編輯的整個步驟。我們的目標是系統性地給送一種載體，它既能進行基因遞送，又能在體內特定細胞類型中進行基因敲除。我們利用這種遞送策略在體內制造經過基因編輯的CAR-T細胞，希望能夠簡化在體外制造經過基因編輯的CAR-T細胞的復雜過程。”

　　Doudna 和她的實驗室將繼續提高 EDV 介導的遞送效率。Hamilton正在進一步開發這種遞送方法。

　　Doudna寫道，“允許在體內提供基因編輯療法的新技術和改進的生產工藝將是降低價格的關鍵，大學、政府和企業之間獨特的合作關系也將是降低價格的關鍵，這些合作關系的共同目標是讓人們能夠負擔得起。僅僅制造這些遞送工具是不夠的。我們必須確保最需要的人能夠用得起這些工具。”