ProtocolofNorthernblot

Protocol of Northern blot
質粒的轉化和擴增
質粒的鑒定
目的基因片段的切割
3.1樣品雙酶切(175μl水解體系)
DW 115μl
Buffer B(10×) 17.5μl
BaM H 15μl
Pst I 17μl
DNA(MMP-9) 16μl
BSA 4.5μl
37℃水浴，3h。
3.2制膠(1.5%Agarose)
0.6g Agarose+40ml TAE(1×)
3.3電泳
175μl樣品+35μl loading buffer(6×)
Marker 5μl +DW 20μl + 5μl loading buffer(6×)
3.4目的基因片段的回收（按照北京鼎國生物發展中心的DNA純化回收手冊進行）
3.4.1 切取含DNA片段的瓊脂糖（100mg-300mg）搗碎按重量比1：3（DNA片段：溶液B）加入溶液B。
3.4.2 50℃水溶10分鐘，直至膠完全溶化，其間旋渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化，如果體積大于500μl，可適當增加溶膠時間，若此時溶液變紅，可加15μl NaAc。（亦可不加）。
3.4.3 將溶液置于離心柱中，靜置1-2分鐘，≥8000rpm離心30S-60S，若一次加不完，可分兩次離心。
3.4.4 倒掉液體，加入500μl溶液C（用無水乙醇1：1稀釋）于離心柱中，8000rpm 30-60S離心，倒掉液體。
3.4.5 用溶液C（用時乙醇1：1稀釋）500μl再洗一遍，8000rpm 離心30-60S。
3.4.6 ≥15000rpm再次離心30S-60S，摔干剩余液體。
3.4.7 將離心柱置于新的離心管中，（此時若離心管蓋蓋不住，不影響實驗結果）加入≥50℃預熱30-50μl（取最低值）溶液D，混勻，靜置2分鐘，≥15000rpm離心60S，管底即DNA。
3.4.8 將DNA貯存于-20℃。
3.5目的基因片段的鑒定
3.5.1電泳（看是否為一條帶）
3.5.2 OD值的測定（主要是確定濃度和質量）
子宮組織總RNA的提取（采用Trizol提取法）
4.1勻漿
每50-100mg組織加入1mlTRIzol。樣品體積不能超過10%TRIzol體積。勻漿。此步后加入氯仿前可放于-60℃～-70℃至少一個月。
4.2可選（對富含脂肪、蛋白的樣品而言）
2-8℃，12000rpm，10分鐘。取上清，移入新管。
4.3水相分離
15-30℃孵育5分鐘。然后，加入0.2ml氯仿（每1mlTRIzol）。用力搖15秒，15-30℃孵育2-3分鐘。2-8℃，12000rpm，15分鐘。離心后，RNA在水相。
4.4 RNA沉淀
轉移水相入新管（注意，保留有機相用于DNA和蛋白的提取），加入0.5ml異丙醇（每1mlTRIzol），15-30℃孵育10分鐘。2-8℃，12000rpm，10分鐘。可見RNA沉淀。
4.5 RNA洗滌
棄上清，每1mlTRIzol加入至少1ml 75%乙醇清洗一次沉淀。2-8℃，7500rpm，5分鐘。
4.6溶解RNA