Science：CRISPR／Cas9大革命

        DNA編輯技術CRISPR近年來風生水起，已經開始取代了其它基因組編輯工具，如鋅指核酸酶和 TALENs等。不過目前科學家們對于這一技術中的RNA引導核酸內切酶：Cas9了解的還不夠多，如果能更精確的掌握這種酶在CRISPR系統中如何發揮作用的，將能提高這一技術的使用效率和特異性。

　　5月16日Science雜志發表了題為“Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution”的綜述性文章，指出近期的一些生化試驗和結構研究有助于解析Cas9這種關鍵酶，這些研究成果為未來合成生物學，轉化醫學研究，以及新一代基因組工程中的新應用奠定了基礎。

　　CRISPR本身是一種防御系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的CRISPR位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA 。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過互補序列結合病毒基因組，并表達CRISPR相關酶，也就是Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。

　　將CRISPR/ Cas系統用于其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個Cas酶，用于切斷靶標DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補結合靶標。

　　其中Cas酶至關重要，為了能更好的利用這一技術工具，不少實驗室解析了這種酶的精確分子機制，探索其如何靶向和作用于DNA的。近期Sternberg等人就確定了Cas9在病毒感染過程中是如何在RNA序列的引導下識別和降解外源DNA，以及在動物和植物細胞中誘導位點特異性遺傳改變的。

　　研究人員通過結合單分子成像和大量的生化試驗，證實Cas9的基因組編輯能力是通過稱作為“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列來實現的。這一研究揭示了PAM的兩個主要功能，解釋了它對于Cas9能夠靶向和切割與導向RNA相匹配的DNA序列如此至關重要的原因。在外源DNA的靶向位點附近存在PAM，而宿主基因組的這些靶向位點則缺乏PAM，使得Cas9能夠精確區分必須降解的非自身DNA和幾乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要條件。

　　研究人員指出，Cas9只在識別PAM后才利用RNA–DNA堿基配對來解讀DNA尋找匹配的序列，這樣避免了意外地靶向細菌自身基因組中的匹配位點。然而，即使Cas9以某種方式與自身基因組中的一段匹配序列錯誤地結合，沒有PAM也無法觸發催化核酸酶的活性。利用這種DNA解讀機制，PAM提供了兩個冗余的檢查點，確保Cas9不會錯誤地破壞它自身的基因組DNA。

　　此外，在結構研究方面，瑞士蘇黎世大學、美國加州大學伯克利分校等處的研究人員今年2月首次解析出酶Cas9的詳細三維結構圖：研究人員利用X射線晶體分析法獲得兩種主要類型的Cas9酶的2.6埃和2.2埃分辨率的晶體結構圖。然后利用單顆粒電子顯微術(single-particle electron microscopy)揭示出Cas9與它的導向RNA(guide RNA, gRNA)如何合作從而與靶DNA序列相互作用。

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　　結構分析顯示Cas9具有相同的結構核心，這個結構核心的特征為一種具有兩個主葉(major lobe)——一個核酸酶結構域葉和一個α-螺旋葉---的蛤蜊形狀(clam-shaped)的結構。這兩個主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結合中發揮功能。

　　還有來自麻省理工等處的研究人員首次報道的Cas9復合體的高分辨率圖片，從中揭示出這種Cas9復合體的勞動分工。

　　研究人員發現Cas9由兩個裂片(lobe)組成：一個裂片參與識別向導RNA和靶DNA組分，另一個裂片負責切割靶DNA，導致雙鏈DNA斷裂從而讓靶基因失去功能。而且他們也發現Cas9與導向RNA之間的界面上的關鍵性結構，當Cas9準備切割靶DNA鏈時，這些結構允許Cas9在導向RNA和靶DNA周圍自我組裝。

　　這些生化機理和結構上的重要成果將有助于解決CRISPR系統應用中的一些問題，從而更好的改進CRISPR技術，滿足科學家們的要求。