T淋巴細胞轉化試驗

一、 基本原理

T 細胞在體外培養時，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出現細胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細胞轉化。淋巴細胞轉化率的高低可以反映機體的細胞免疫水平，因此可作為測定機體免疫功能的指標之一。

淋巴細胞轉化試驗有形態計數法、MTT 法和同位素法三種。MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT 是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到ConA 作用后發生增殖活化，其胞內線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT 作為其底物參與反應，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內或細胞周圍，經鹽酸─異丙醇溶解后為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養物的OD 值，測定波長570nm。根據OD 值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。

3H-TdR 摻入法：細胞增殖的基本條件或前提為細胞質和細胞核的復制，這是正常細胞增殖過程缺一不可的前提。一般來說，一個細胞周期可大致分為四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動為DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine），是DNA合成的前體。加入細胞培養液中后被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多，因此，檢測所摻入的3H-TdR就可反映細胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實習中仍用MTT法。

二、 實驗材料

1. ICR 小鼠（北京大學醫學部實驗動物中心提供）

2. RPMI1640 培養液

3. Hank's 液

4. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI1640 液配成1mg/ml，分裝小瓶，冷凍保存

5. MTT 1mg/ml

6. 2.5%碘酒、75%酒精

7. 無菌尖吸管和刻度吸量管

8. 無菌解剖器械

9. 96 孔平底培養板

10. 5%CO2培養箱（美國NAPCO公司產品）

11. 酶標測定儀 （美國BioRad 公司產品）

三、 實驗方法

1. 小鼠脾細胞懸液的制備：

取一個滅菌的平皿，加入5ml Hank's液。頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，放入平皿中，在鋼網上研磨并過篩，制成細胞懸液。取出100μl用于計數。將其余細胞懸液移入一離心管中，離心1500rpm，7min，（或1000rpm，10min）棄去上清，用RPMI1640 培養液稀釋，制成2.5×106 / ml的脾細胞懸液，然后加入ConA使每孔最終濃度為2μg/ml，同時做不加ConA的陰性對照孔。

2. 將上述細胞懸液加入96 孔平底培養板中，每孔0.1ml。

3. 將培養板放入含有5%CO2的37℃培養箱中培養48-72 小時，在培養結束前4-6 小時，于培養板各孔內加入1mg/mlMTT液，10μl/孔。370C培養6 小時。

4. 各孔內加入0.01M 鹽酸—異丙醇110μl，30 分鐘內（或加2%SDS 100ul/孔，過夜）用酶標測定儀測OD 值，測定波長570nm。

四、 實驗結果

將實驗組和對照組三個復孔的OD 值平均。

轉化值=實驗組的平均OD 值-對照組的平均OD 值。

五、注意事項

（1）由于本實驗需要培養3 天，才能觀察結果。因此，在操作時應注意無菌操作，避免細菌污染，導致實驗的失敗。

（2）細胞操作要輕柔、迅速，以免細胞損傷影響實驗結果