7年分子克隆經驗總結
做了快7年的分子克隆，從加樣加不好，到現在輕松PCR，我想分子生物學這塊還是有很多經驗可以分享一下的。或許很多人會說分子克隆過程中出現問題最多的大概就是連接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在個步驟上很久。經過長時間的摸索我在連接這個問題上有一些體會，我認為連接的問題多集中在連接的體系、DNA的用量、vector和insert的比例、連接酶等。但是我認為，連接不成功，問題并不一定出在連接這步上。有很多環節影響連接的成敗，如酶切的好不好、回收的質量好壞、連接時的濃度或比例、感受態等。以下我詳細說明。1，PCR引物的設計。通俗地說，很多人用了很多軟件設計來設計去，又是考慮發夾結構，又是考慮二聚體，又是考慮Tm值，折騰來折騰去，但其實沒那么復雜。首先保證你要的基因是正確的，這個可以從NCBI中找到，大部分是沒問題的，然后再找到起始密碼子，從那開始大概上游取20-27bp，加上酶切位點，加上保護堿基（一般3個）就是上游引物，取后20-27b......閱讀全文
分子克隆蛋白表達實驗指南（四）
7. PCR產物與TA載體連接?? pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation ? efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.? +A s
分子克隆蛋白表達實驗指南（一）
目的基因克隆包括保存用全長基因(gene for saving, GS)和表達用全長基因(gene for expression, GE)兩部分。? 這兩部分所克隆的基因都是全長片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精確克隆(及引物從基因CDS兩端開始)很難找到高效價的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表達實驗指南（六）
10. 測序? 突變后氨基酸序列沒有變化仍可用于表達。測序報告中blast時若有‘－’符號，則人工對照測序圖譜。? 測序驗證后沒有突變或者同義突變的重組質粒必須小抽，50ul，conc300ug/ml備份。測序文件應妥善保存，蛋白表達完成后一并提交存檔。? 獲得GS后，即可構建含GE的重組T載體，用
分子克隆蛋白表達實驗指南（九）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4?????????? M：marker；上樣10ul? UI：未誘導對照；10ul? BS：超聲前樣品；10ul? S：超聲后上清； 10ul? P：超聲后沉淀； 10ul? T：誘導后每隔1h樣品，1
分子克隆蛋白表達實驗指南（二）
取DEPC水時切記帶上手套?? ? Genequant使用方法：? 開機－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否為320nm)－set-ref(此時插入空白對照)－樣品? 1．使用前將比色皿中水吸出，用1ml蒸餾水重新洗滌再將比色皿中的水吸盡（先用1ml槍吸，后用100ul槍吸）
分子克隆蛋白表達實驗指南（八）
15. 小量蛋白誘導表達????? 該步驟的目的是檢測蛋白是否在上清存在表達。低溫時蛋白易于表達于上清，因此小量蛋白誘導表達以20或30C為培養溫度。? 1. 挑一單克隆的菌落于5ml含有相應的抗生素的LB培養液中，37℃振蕩培養過夜（8-16h）。? 2. ? 過夜培養液加入三瓶50ml含
分子克隆化DNA片段的制備介紹
常用以下方法獲得DNA片段： ①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段； ②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段； ③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段； ④從mRNA反轉錄產生cDNA。
簡述分子克隆化的重要意義
在醫學方面，利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、松弛素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生產。還可提高微生物本身所產生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產量。 在基因治療方面。通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞
分子克隆化載體DNA的選擇介紹
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以
關于分子克隆化引入寄主細胞的介紹
常用兩種方法： ①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DN
分子克隆實驗引入寄主細胞的常用方法
常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DNA分子比
分子克隆化DNA片段與載體連接介紹
DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有： ①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。 ②平頭末端連接，用物理方法制備的DN
小分子藥物單克隆抗體制備
在單克隆抗體制備中，首先進行的就是抗原的設計與合成，這是制備單抗成功與否的關鍵。因為產生抗體的特異性與親合性是與抗原密切相關的，合成的抗原如果可以將所需要的抗原決定簇充分暴露出來，那么機體更容易識別抗原決定簇，從而免疫的動物所產生的抗體自然會在特異性和親合力上最大程度的與抗原決定簇擬合。所以，在制備
分子克隆技術在醫學方面的應用
利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、松弛素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生產。還可提高微生物本身所產生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產量。
PCR經驗總結（一）
(首先聲明，此文不如分子克隆第三版權威與分子克隆相背處，請信分子克隆)增加PCR的特異性1. primers design ?? 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件a? 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同
PCR經驗總結（二）
5. touchdown PCR?? 原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度94 5min?? 94 30s?? 60 30s?? 72 1min 2cycles?? 94 30s?? 59 30s?? 72 1min 2cycles?? 94
細胞消化經驗總結！
一、酶消化法1、胰酶。這是用得多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存
化學小分子或開啟治療性克隆新時代
1997年克隆羊多莉的誕生點燃了人們對克隆技術造福人類健康的巨大熱情，然而該技術的進一步應用受到人類卵母細胞來源的限制及對胚胎破壞帶來的倫理制約。北京大學生命科學學院鄧宏魁教授和趙揚博士帶領的研究團隊，用一種非常簡單且更加安全的方法，將體細胞制成多潛能性干細胞。這一技術手段避免了上述風險，將極大
分子克隆實驗指南第四版發售
在生命科學領域，沒有一本書比它更紅，幾乎每個實驗室都有，幾乎每個人都翻過。它就是《分子克隆實驗指南》。30年前，這本書誕生于冷泉港實驗室出版社，它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆講習班實驗方案的匯編。7年后，該書又出了第二版。當時的人們也許未曾料到，這部著作在20年的時間里竟成為指導生命
分子克隆實驗DNA片段與載體連接方法介紹
DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭
細胞消化的經驗總結
一、酶消化法1、胰酶。這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25% 的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活
RtPCR經驗總結
Rt-PCR實驗步驟一、實驗器具與材料：1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸頭：1ml、200μl、20μl3、勻漿管：5ml4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，
分子克隆技術在農業生產方面的應用
植物遺傳工程對提高農作物的產量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。
分子克隆技術在基因治療方面的應用
通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血癥，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血癥患者的離體培養細胞，發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，并確實能代謝半乳糖。
分子克隆技術在環境保護方面的應用
在環境保護方面，人們根據需要進行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創造一些對有害物質降解能力更強的新菌種，以分解工業污水中的有毒物質。在食品工業方面，細菌可為人類生產有價值的蛋白質、氨基酸和糖等。
單克隆抗體技術的類型小分子抗體簡介
小分子抗體顧名思義是分子量較小的抗體片段，它的抗體分子的抗原結合部位僅僅局限于重鏈和輕鏈的可變區。雖然分子很小但它既保持了親本單抗的親和力具有親本單抗一樣的特異性。種類主要包括:抗原結合片(Fab)抗體、Fv抗體、單鏈抗體、單域抗體與最小識別單位。 1.Fab抗體 Fab抗體為僅含Fab分子
分子克隆技術在工業生產方面的應用
以分子克隆技術為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發酵工程，四者緊密聯系、常綜合利用。許多化學試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術得到產品。
有機合成操作的經驗總結
選擇玻璃儀器和攪拌子：（1）均相反應：物料不超過容器體積的2/3；（2）非均相、回流或者產生氣體的反應：物料不超過容器體積的小于1/2，無水無氧的反應時更應注意。攪拌裝置的選擇：（1）機械攪拌：物料體積>2 L的非均相體系；（2）強力攪拌：物料體積>3 L的均相反應和250 mL~2 L的非均相體系
western－blot失敗經驗總結1
我做了很久的WB，最大的一個難點感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadi
急診科醫生經驗總結
? 1.對發熱伴頸部淋巴結腫大的青少年患者，如抗生素治療無效，要想到壞死增生性淋巴結病的可能。??? 2.對中老年昏厥患者，要優先考慮心源性的（冠脈或惡性心律失常），不管既往有無類似發作史。??? 3.以消化道癥狀為主訴的中青年患者，要想到急性重癥心肌炎的可能。??? 4.老年納差的，會不會是吞咽困