mRNA的提取及純化（磁珠法和親和柱層析法）

真核細胞的mRAN是單順反子，其最顯著的特征是具有５'端帽子結構和3'端的poly A的結構，此poly A結構為mRNA的提取提供了有效的途徑，人們利用堿基配對原理，采用寡聚Ｔ結構作為親和柱材料，當含mRNA的總RNA樣品流經寡聚Ｔ柱時，mRAN即被特異性的結合到柱上，從而可與其它RNA相分開，這就是寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親和柱分離mRAN的原理。目前雖然mRNA的提取已有多種方法，如超速離心法、免疫法，但較常用的、簡便的方法還應是柱層析法。不過近幾年,mRNA的提取方法又有所改進和突破,mRNA的磁珠分離即是這些新方法中的一類主要技術。該技術建立于３類強有力的相互作用上，即A與T堿基間的強配對性；鏈菌素抗生物素與生物素間的強免疫作用及稀土元素磁鐵與順磁性物質間的強磁性作用。mRNA的磁珠分離技術提取mRNA的原理主要為用生物素標記的Oligo(dT)與mRNA3'端的poly A退火形成雜交體，然后用帶有親和素(鏈菌素抗生物素)的順磁磁珠洗滌并捕獲雜交體，形成雜交體－磁珠復合體，最后用磁架將此復合體捕獲，這樣mRNA即可與其它形式的RNA相分開，進一步用無RNase無菌水洗滌，即可獲得純化的mRNA。
方法一:磁珠法提純mRNA
一：儀器 水浴離心機 取液器 分光光度計

二：試劑 mRNA 分離系統試劑盒,異丙醇， 3MNaAC
三:磁珠法分離mRNA的原理圖示如下：
四：操作
（一 ）生物素標記的Oligo(dT)探針與mRNA的煺火
１：在DEPC處理過的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的總RNA和無RNase的水至終體積為0.5ml。
２：65℃加熱10min
３：加入2μl生物素標記的Oligo(dT)探針和12μl的20×SSC于RNA中輕輕混勻，室溫放置，逐漸冷卻平衡至室溫，此步操作一般需10min。
（二）親和素順磁磁珠（SA-PMPS）的沖洗
4：將SA-PMPS輕晃開后，放入磁性分離架中，使SA-PMPS集中于試管一則(約30秒)， 小心去除上清（不用離心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，漂洗３次。
5：將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2ml0.5×SSC中。
雜交體的生成及漂洗
6：將上步"３"中褪火的生物素標記的Oligo(dT)探針，全部加到上步"5"管中,輕輕混勻，室溫放置10min。每隔2分鐘輕輕混勻一次
7：用磁性分離架捕獲磁珠，吸棄上清。
8：用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，吸棄上清，漂洗4次。
（三）洗滌收集mRNA
9：將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2mlDEPC水中。
10：用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中。重復洗滌一次，吸取水相，兩次水相合并(約0.25ml)
11：在洗脫液中加入0.1體積的NaAC,1體積的異丙醇，－２０℃沉淀過夜，12000g 離心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

12：提取mRNA質量的分光光度計檢測，將所提mRAN分別在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提樣品在OD260％的值為1 .
13:提取mRNA質量的電泳檢測，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應在0.5-8Kb間均勻著色，1.5-2Kb間著色較強。
方法二:親和柱層析法提純mRNA
該方法利用mRNA上的寡聚A可與較聯寡聚T的纖維素柱在高鹽下以堿基配對形式發生親和吸附，而在低鹽下，堿基配對能力破壞，吸附解除，而其他成分的RNA則不具該特性，因此在高鹽下當RNA抽提樣品流經該柱時，mRNA被掛在柱上，而其他RNA則隨高鹽溶液流出；當用低鹽洗脫液洗柱時，mRNA隨洗脫液流出。再用有機溶劑沉淀則可得純化mRNA。
一：儀器，層析系統，其他同方法一
二：試劑，
柱材Oliga(dT）－纖維素
上樣液：20mMTris-HCL(pH 7.6)
0.5M NaCL
1mM EDTA (pH 8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸鈉（SLS）
洗脫液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)
1mM EDTA(pH 8.0)
0.05% SDS
三：操作
1：DEPC處理層析柱
2：0.1M NaOH處理Oliga(dT）－纖維素
3：用1×上樣液洗柱至pH< 8.0
4:無菌水溶解RNA，65℃溫浴5分鐘后，迅速冷卻至室溫，加等體積2×上樣液，上樣，分部收集。
5：1倍體積1×上樣液洗柱，分部收集。
6：OD260沉淀收集液，確定收集液的該值是否接近0，如該值仍很大，則上樣液繼續洗柱，直至該值接近0。
7：2－3倍柱床體積的洗脫液，洗柱，分部收集。
8：測定各收集管的OD260，將有吸光值的各管合并。
9：進行方法一的“11－13”步。