mRNA的PCR差異顯示實驗

人的細胞總 RNA 或 poly（A）＋ RNA

人胎盤 RNase 抑制劑DNase ITris·ClKClMgCl23：1 （V V） 苯酚 氯仿乙酸鈉乙醇DEPC 處理的水簡并錨定 oligo（dT） 引物組合MoMuLV 逆轉錄酶緩沖液DTT4dNTP 混合物MoMuLV 逆轉錄酶PCR 擴增緩沖液［α-33P］ dATP隨機十聚體Taq DNA 聚合酶礦物油甲酰胺上樣緩沖液糖原（無 DNase）

65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴熱循環儀Whatman 3 MM 濾紙

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 消化細胞總 RNA 或 poly（A）^＋ RNA 中的 DNA：

50 ug RNA

10 ul 1 U/ul 人胎盤 RNase 抑制劑

1 /ul 10 U/ul 無 RNase 的 DNase I

5 ul 0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3

5 ul 0.5 mol/L KCl

5 ul 15 mmol/L MgCl₂

加水到 50 ul

37℃ 溫育 30 min。

2. 加入 50 ul 酚/氯仿（3：1），渦旋混勻，最高速離心 2 min 分相。

3. 轉移上層到一個干凈的微量離心管中，加入 5 ul 3 mol/L 的乙酸銨和 200 ul 100％ 乙 醇。-70℃ 放置 30 min 沉淀 RNA。

4. 高速離心 10 min。去除上清，用 500 ul 70％ 的乙醇洗滌沉淀（沉淀的 RNA）。

5. 溶解 RNA 沉淀于 20 ul DEPC 處理水，用分光光度計測量 A₂₆₀ 準確定量 RNA 的濃度。

6. 用瓊脂糖/甲醛凝膠電泳分析 3 ug 用作差異顯示分析的 RNA，檢査 RNA 的完整性。無 DNA 的 RNA 保存在 -80℃ 直到做差異顯示分析。

7. 對于每一個 RNA 樣品，標記 4 個微量離心管為 G、A、T 和 C 個管子對應一個簡并錨定 oligo （dT） 引物。

8. 把 1 ug 無 DNA 的 RNA （步驟 5）稀釋到 0.1 ug/ul， 置于冰上。

9. 用 4 個不同的簡并錨定引物（5'-T₁₂MN-3'；T₁₂MG、T₁₂MA、T₁₂MT、T₁₂MC，M 是 G、A 或 C） 配制無 DNA 的總 RNA 或 poly （A）^＋ RNA 的逆轉錄反應：

4 ul 5×MoMuLV 逆轉錄酶緩沖液（終濃度 1×）

2 ul 0.1 mol/L DTT （終濃度 10 mmol/L）

1.6 ul 250 umol/L 4dNTP 混合物（終濃度 250 mmol/L）

0.2 ug 總 RNA 或 0.1 ug poly （A）^＋ RNA

2 ul 一個 10 umol/L 簡并錨定 oligo（dT） 引物（T₁₂MN； 終濃度 1 umol/L）

DEPC 處理水調整體積到 19 ul。

10. 65℃ 溫育 5 min 變性 mRNA 的二級結構，繼續 37℃ 溫育 10 min 復性引物。

11. 每管加入 1 ul 200 U/ul 的 MoMuLV 逆轉錄酶，混勻，37℃ 溫育 50 min。

12. 95℃ 加熱 5 min，滅活逆轉錄酶，高速離心把溶液收集到管底。把管子放在冰上馬上準備 PCR，或保存在 -20℃ 以備日后使用（可以穩定保存至少 6 個月）。

13. 為每個引物準備如下 20 ul 的反應混合液：

10 ul H₂O

2 ul 10× 擴增緩沖液（終濃度 1×）

1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物（終濃度 2 umol/L）

0.2 ul ［α-³³P］ dATP

2 ul 12 umol/L 的隨機十聚體（終濃度 0.2 umol/L）

2 ul 10 umol/L 的簡并錨定 oligo（dT） 引物（T₁₂MN； 終濃度 1 mmol/L）

2 ul cDNA （12 步）

0.25 U 5 U/ul Taq DNA 聚合酶

14. 上下吹吸混勻，覆蓋 25 ml 礦物油。

15. 在熱循環儀上用如下程序擴增：

40 輪：

30 s 94℃ （變性）

2 min 40℃ （復性）

30 s 72℃ （延伸）

1 輪：

5 min 72℃ （延伸）

最后一步：4 C （保持）

16. 混合 3.5 ul PCR 產物和 2 ul 甲酰胺上樣緩沖液，80℃ 加熱 2 min。上樣到 6％ 的變性聚丙烯酰胺凝膠上。60W 電泳約 3 h 直到二甲苯青走到離底部 10 cm 以內。

17. 小心移去凝膠上的一塊玻璃板。把一張 Whatman 3 MM 濾紙覆蓋在凝膠上，在凝膠和濾紙之間不要留有氣泡。不需要在甲醇/乙酸中固定，室溫干凝膠約 1 h。

18. 使用放射性墨水或鐘頭打孔器標記 X 射線膠片和干好的凝膠移確定它們的方向。室溫曝光 24～48 h。

19. 洗片，把凝膠片和凝膠比照，標出感興趣的 DNA 條帶（在不同泳道差異顯示的條帶）或用一支干凈的鉛筆或割穿凝膠片在凝膠片下作標記。

20. 用刀片割出凝膠塊和黏附其上的 Whatman 3 MM 濾紙，放人一個微量離心管。加入 100 ul H₂O， 室溫浸泡 10 min。

21. 蓋上管子煮沸 15 min。

22. 高速離心兩分鐘沉淀凝膠塊和濾紙殘渣。轉移上清到一個干凈的管子里。

23. 上清中加入 10 ul 3 mol/L 的乙酸鈉（終濃度 0.3 mol/L） 和 5 ul 10 mg/ml 的糖原 （作為載體）。加入 400 ul 100％ 的乙醇，-70℃ 放置 30 min。4℃ 高速離心 10 min。

24. 用 500 ul 85％ 的乙醇洗滌沉淀，晾干，重新溶解于 10 ul H₂O 中。

25. 在一個 40 ul 的反應體積里再次擴增 4 ul 洗脫的 DNA。使用和步驟 13～15 中同樣的簡并描定引物和 PCR 條件，不同的是加入 250 umol/L 4dNTP 混合物（終濃度 20 umol/L） 代替 1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物，也不加同位素。-20℃ 保存剩余的回收 DNA 以備將來擴增（可穩定數年）。

26. 取每個 PCR 樣品 30 ul 在 1.5％ 的瓊脂糖凝膠上電泳，用 0.5 ug/ml 的 EB 染色。20℃ 保存剩余的 PCR 樣品（可以穩定保存數年）。

27. 從瓊脂糖凝膠上抽提所希望擴增的 DNA 條帶。用它作探針進行 North-era 印跡分析和 cDNA 庫的篩選。

28. 亞克隆，測序鑒定余下的 PCR 樣品。

必須由受過正確使用 ³³P 同位素的人員在經 NRC 認證的地方進行。防止過量的照射，必須始終貫徹人員和儀器的同位素污染防范標準。

1. 材料

人的細胞總 RNA 或 poly （A）^＋ RNA

2. 試劑

1 U/ul 人胎盤 RNase 抑制劑

10 U/ul DNase I （無 RNase）

0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3

0.5 mol/L KCl

15 mmol/L MgCl₂

3：1 （V/V） 苯酚/氯仿

3 mol/L 乙酸鈉，pH 5.2

100％、70％ 和 85％ 的乙醇

DEPC 處理的水

濃度各為 10 umol/L 的簡并錨定 oligo（dT） 引物組合 （如 Genhunter）： T₁₂MG、T₁₂MA、T₁₂MT， T₁₂MC （M 代表 G、A 或 C）

5 × MoMuLV 逆轉錄酶緩沖液

0.1 mol/L DTT

250 umol/L 和 25 umol/L 的 4dNTP 混合物

200 U/ul 的 Moloney 鼠白血病病毒（MoMuLV） 逆轉錄酶

10× PCR 擴增緩沖液（使用 15 mmol/L MgCl₂， 0.1 mg/ml 白明凝膠；保存在 -20℃）

10 uCi/ul ［α-³³P］ dATP（＞2000 Ci/mmol）

2 umol/L 隨機十聚體（如 GenHunter 或 Operon Technologies）

5 U/ul Taq DNA 聚合酶

礦物油

甲酰胺上樣緩沖液

10 mg/ml 的糖原（無 DNase）

3. 耗材

65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴

熱循環儀

Whatman 3 MM 濾