mRNA的S1作圖實驗

mRNA

瓊脂糖 電泳緩沖液 ATP 寡聚核苷酸引物 多核苷酸激酶緩沖液 T4

離心機 分光光度計 搖床

一、圖片簡介
 

二、實驗步驟
 

1.  用1×堿性制膠緩沖液制備1.2%的低融點瓊脂糖，并將凝固好的膠在1×堿性電泳緩沖液中浸泡過夜。

2.  將以下試劑混合以制備磷酰化的寡聚核苷酸：

（1）20 μl   ［γ-³²P］ATP（10 mCi/ml，共200 μCi）

（2）1 μl  100 μg/ml 寡聚核苷酸引物

（3）25 μl  10×多核苷酸激酶緩沖液

（4）4 U  T4多核苷酸激酶

（5）30℃反應30 min 后，65℃加熱5 min 滅火激酶。

3.  將溶于55 μl 水的18 μg 單鏈模板DNA和9 μl 10×TM緩沖液加入已磷酸化的寡聚核苷酸中，40℃雜交15 min。

4.  加入9 μl 4 mmol/l dNTP混合液和2 μl klenow酶，37℃保溫30 min 以延伸寡核苷酸模板，65℃加熱5 min 滅活klenow酶后置于冰浴。

5.  加入10 μl 10×限制酶緩沖液和40 U 限制性內切酶，37℃保溫45 min 切割探針，65℃加熱5 min 滅活限制酶。

6.  加入100 μl 5mol/l 乙酸銨和500 μl 乙醇，-20℃沉淀過夜或干冰/乙醇中放置15 min，在微量離心機中離心15 min，晾干沉淀。

7.  將沉淀物重溶于25 μl 堿性加樣緩沖液。加樣并在最大電壓降為1.8 V/cm 下電泳4 h。

8.  疑膠用X光感光片曝光5 min，沖洗感光片，對比凝膠和感光片，切下探針所在處的凝膠。

9.  將切下的凝膠移入一個微量離心管中，65℃融化，確定體積后，加入等體積的TE緩沖液，再在65℃保溫10 min。

10.  加入1 μl 10 mg/ml tRNA和緩沖液平衡酚抽提2次后（不要用酚/氯仿），加入0.1體積的3 mol/l pH5.2的乙酸鈉緩沖液及2倍體積無水乙醇沉淀。

11.  沉淀用100 μl 0.3 mol/l乙酸鈉重溶，取1 μl 進行切倫科夫計數。

12.  在不多于50 μg RNA中加入5×10⁴切倫科夫計數的探針，調整最終體枳為100 μl，鹽濃度為0.3 mol/l 乙酸鈉，加入250 μl 乙醇沉淀。

13.  以70%乙醇/30%DEPC處理過的水沖冼，并倒扣在Kimwipes紙上晾干30 min。

14.  重溶沉淀于20 μl S1雜交液，65℃變性10 min，30%雜交過夜。

15.  每個反應中加入以下S1核酸酶反應混合物： 

（1）150 μl  2×S1核算酶緩沖液

（2）3 μl  2 mg/ml單鏈小牛胸腺DNA

（3）147 μl  水

（4）300 U  S1核酸酶

（5）60℃反應30 min，加80 μl S1終止緩沖液以終止反應。
 

16.  加1 ml 無水乙醇，沉淀。以70%乙醇冼沉淀，在Speedvac蒸發器中干燥5 min。

17.  重溶于3 μl TE緩沖液和4 μl 甲酰胺加樣緩沖液，煮沸3 min后，置于冰上。

18. 按下面的提示制備合適濃度的聚丙烯酰胺/尿素凝膠。
 

19.  在凝膠上加樣3~5 μl 進行分析，凝膠放射自顯影后確定標記DNA片段的大小。