miRNA檢測的三種方法

MicroRNA  (miRNA)是一種機體內源性表達的單鏈小分子RNA，位于基因組非編碼區，本身不具有開放閱讀框(open reading frame，ORF)，具有高度保守性，時序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細胞中，不編碼任何蛋白質，長度僅為20～24nt。成熟的miRNA 5′端有一個磷酸基團，3′端為羥基，由具有發夾狀結構的約70～90nt的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA誘導的基因沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)作用于靶點mRNA，通過對mRNA剪切或抑制其翻譯過程而調控基因的表達。目前人們還不明確miRNA及其靶mRNA之間的作用機制。

最近有研究指出，miRNA  在細胞生長、發育、分化、死亡等生物過程中起著重要的作用，同時，miRNA參與了血細胞生成、胰島素分泌、神經系統構成和人類癌細胞生長等不同的過程，因此，非常有必要開發有效的實驗工具來測定miRNA。

目前檢測miRNA的方法主要有Northern  印跡分析，微點陣(microarray)分析和實時定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。下面將對這三種方法做簡單的介紹及比較。

1、Northern  印跡分析(Northern Analysis)

Northern  印跡是基于雜交檢測RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的幾種方法之一。這種方法簡單易行，大部分實驗室都可以進行操作，不需要額外的資金投入與設備更新。

不足之處：

1)Northern分析的過程涉及大量人工操作，并且每次僅有一條miRNA探針與一個RNA印跡雜交，因此，它適用于不適用于大規模的篩選實驗。盡管如此，在簡單探究miRNA功能機理的實驗中，Northern印跡分析還是能夠滿足研究需要的。

2)Northern印跡分析的動態范圍只能達到兩個數量級，這就引發了一個嚴重的問題，進行實驗的細胞內的miRNA分子的數量要達到比較大的范圍，例如，能夠檢測40,000個miRNA分子每細胞的印跡條件實際上卻不能準確檢測10個miRNA分子每細胞。另外，由于Northern印跡以雜交為原理，它通常不能有效區分具有細微序列差異的miRNA。例如，同一個家族中的miRNA let-7c與let-7a和let-7b之間僅有一個堿基的差異，導致Northern印跡分析無法清晰區分它們。此外，Northern印跡實驗的重復性較弱。

3)Northern印跡耗時，耗量。進行一次miRNA檢測需要3個工作日，不僅減慢了實驗進程，也增加了雜交膜上信號擴散的風險。此外，Northern印跡大概需要5到10微克的總RNA量上樣量才能成功檢測出miRNA，增加了檢測干細胞或人類初期腫瘤細胞這些稀少的樣品的難度，甚至無法順利開展實驗。

2、微點陣(Microarray)分析

微點陣分析也是基于雜交的原理來檢測miRNA，它通過測定特定過程中miRNA的表達水平，來分析了解miRNA的表達調控機制以及由miRNA調控的基因的表達。微點陣采用高密度的熒光標記探針與RNA樣本雜交，通過熒光掃描獲得表達圖譜，借助相應軟件進行miRNA的表達分析。由于在設計探針時可以包含所有可用miRNA序列，因此微點陣可以作到高通量的miRNA分析。

不足之處：

1)微點陣仍然需要足夠的RNA初始樣本，大約為每個微點陣5微克。

2)由于微點陣以雜交為基礎，因此同Northern印跡一樣無法清楚的區分序列差異很小的miRNA。另外，微點陣也很難區分具有相同序列的前體miRNA和成熟的活性miRNA。

3、定量實時PCR(Quantitative Real-time PCR)

定量實時PCR技術通過擴增技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。起始目標核酸的拷貝數越高，就越快觀察到熒光強度的顯著增加。定量實時PCR中TaqMan?? (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特異性分析依賴于兩個PCR引物和一個序列特異的TaqMan探針的聯合作用。這些熒光標記的探針利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，極大的提高了實時PCR的檢測，從而使得對PCR后期加工中探針的降解分析的評估成為可能。

盡管定量實時PCR相比Northern分析和微點陣需要較少的樣本，并且顯著的提高了動態范圍和敏感度，但是這種技術在檢測miRNA時還是遇到了挑戰。由于成熟miRNA長度較短，難以設計成熟miRNA的有效的特異引物和探針，于是很多研究者對較長的前體miRNA分子進行定量實時PCR檢測，利用前體miRNA的水平作為成熟的活性miRNA的替代標記。然而細胞內存在的前體miRNA的水平不能有效的指示相應的成熟miRNA水平，因此這種方法無法達到預想中的效果。

目前已有新的定量實時PCR的方法被用來解決檢測miRNA中遇到的這些問題。這種新方法利用一種莖環(stem-loop)狀引物進行miRNA的反轉錄，然后再進行定量實時PCR。這個莖環狀結構對成熟的miRNA 3′ 端具有特異性，能夠將非常短的成熟miRNA分子擴展并且增加一個通用的3′ 引物位點進行實時PCR。這種莖環狀結構也被認為可以形成一種空間的阻礙以防止對前體miRNA進行PCR引導。然后就可以利用實時PCR進行高特異性的定量檢測miRNA的表達水平。這種實時PCR的優點是：1)可以在起始樣本量很小的情況下進行(RNA總量在1到10ng之間)。2)動態范圍達到了7個數量級，因此可以檢測大量或者少量的miRNA。3)這種方法可以區分只有一個堿基差別的miRNA。4)和傳統的定量實時PCR檢測相比，在實驗室中生產這些新的莖環狀結構是很快并且很簡單的。

三種檢測方法的比較