qpcr實驗流程

Q-PCR 實驗流程

一、實驗前準備，每天早上到實驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開 15-20 分鐘。2超凈臺前做實驗，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需 帶口罩。

3取 EP 管/槍頭時需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完 EP 管/槍頭后，袋子及時封好。@橡膠手套須放入超凈臺照射紫外，實驗操作過程 中不得帶出超凈臺，移液器在一天工作結束后調至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。

G實驗進行的過程中或觀看實驗時沒有帶口罩不要在超凈臺前講話。

二、總 RNA 抽提

1)細胞培養皿中細胞樣品用 1*PBS 洗兩次后，用1m 槍將 PBS 吸凈，加入lml Trizol(invitrogen)溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使細胞充分裂解，室溫靜置 5min;

組織樣品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混勻，室溫放置5min 使其充分裂解:(管蓋與管壁都需標記樣品名稱)。

2)加入 200!1氯仿，劇烈振蕩混勻 30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3-5min;(離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，

與第一步的順序一致)

3) 4C下，14,000g 離心 15min，可見分為三層，RNA 在上層水相，移至另一個新的 RNase free EP 管:(用 20-200ul 的槍吸取上清，吸清時，槍頭應沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層)。

三、去基因組

使用 RNase-free的DNase I(Promega)，按以下體系配置反應液，37C消化30min，65C滅活10min。