| A．siRNA轉染的方法 哺乳動物轉染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質體試劑，其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面：1. 轉染試劑的用量2. siRNA的用量3. 轉染時的細胞密度4. 轉染時的操作順序5. 細胞與轉染試劑/siRNA復合物的溫浴的時間 B． SiMi Transfection Reagents 轉染試劑 選擇最適合的轉染試劑和轉染條件，往往取決于不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。SiMi Transfection Reagents適用于核酸的體內和體外操作，可應用于DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉染，也可應用于DNA/siRNA的共轉染操作；是一種新型的高效siRNA轉染試劑。SiMi Transfection Reagents的應用領域：1. 原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染2. siRNA高通量轉染試驗3. DNA轉染；DNA和siRNA的共轉染4. 核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內導入試驗5. 貼壁細胞和懸浮細胞轉染SiMi Transfection Reagents 的特點：1. 不必更換培養基，操作簡便易行，可在半小時內完成操作2. 在含血清培養基中也能表現高轉染效率3. 細胞毒性低；適用細胞廣泛4. 即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養基中轉染5. 基于脂質的轉染試劑，確保沒有RNAse活性6. 可介導siRNA高轉染細胞及體內siRNA的高效導入 C．SiMi Transfection Reagents適用的細胞類型SiMi Transfection Reagents轉染試劑可廣泛應用于多種細胞系的DNA和siRNA轉染如：HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。D．轉染前細胞培養在細胞板上培養細胞時，應使細胞匯合在24小時內達到70-90%。 細胞培養用品表面積（mm2/孔）細胞密度培養基（μL /孔）96孔板501.5′104-5.0′104100μL48孔板1003.0′104-1.0′105200μL24孔板2008.0′104-2.0′105500μL12孔板4011.6′105-4.0′1051.0 mL6孔板9623.0′105-8.0′1052.0 mL35 mm9623.0′105-8.0′1052.0 mL60 mm28271.0′106-2.5′1066.0 mL E. 合適的SiMi Transfection Reagents用量合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對核酸的高效轉染有重要影響；我們推薦的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：SiMi Transfection Reagents為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此范圍內都可獲得高的轉染效率。細胞培養用品siRNA/DNA培養基最終體積SiMi Transfection Reagents(siRNA/DNA)96孔板5pmol/0.2μg100μL0.25μl/0.5μl24孔板20pmol/0.8μg500μL1μl /2μl12孔板40 pmol /1.6μg1 mL2μl /4μl6孔板100 pmol /4.0μg2 mL5μl /10μl35 mm100 pmol /4.0μg2 mL5μl /10μl60 mm600 pmol /8.0μg5 mL10μl /20μl F．貼壁細胞轉染程序選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和SiMi Transfection Reagents的用量和兩者的比例可在推薦范圍內適當調整。1. 轉染前一天，4-5?104細胞接種在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養基）細胞培養基。2. 選擇用于初期接種的細胞數量，應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；4. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉染時，則加入2μlSiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；5. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復合物。6. 將100μl siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板板。7. 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養基。 G．懸浮細胞轉染程序1. 轉染的當天，收集細胞離心，用含FBS的培養基重懸。2. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清的培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；3. 混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl SiMi Transfection Reagents試劑（DNA轉染時，則加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；4. 將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）復合物。5. 再加入400μL細胞懸浮液（細胞數量決定于細胞類型和轉染后分析測試的時間）。6. 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時后，除去復合物，更換培養基。 <, FONT, face="Tahoma">H．DNA和siRNA共轉染細胞程序1. 在轉染的前一天，4-5?104細胞接種在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的細胞培養基。2. 選擇用于初期接種的細胞密度，應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。3. 在100μL的無血清的培養基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl SiMi Transfection Reagents試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復合物。4. 將siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents復合物加入培養基中，輕輕混勻。5. 細胞在37℃溫育24h-48h后，進行轉染后的其它步驟。 I．siRNA體內導入方法1. 適量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，因為注射液體積有限，建議采用高濃度的siRNA或DNA，一般DNA為2μg /μL、siRNA為10μg /μL。2. 取適量的DNA、siRNA或siRNA\DNA復合物與SiMi Transfection Reagents混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的SiMi Transfection Reagents（24μg）和0.45μL不含RNA酶的無菌水中，將1#管中的溶液加入2#管中，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagents復合物。3. 制備的siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagentse復合物可用于體內導入siRNA、DNA或siRNA\DNA。 |
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