人類血小板抗原1～4系統基因分型

關鍵詞： PCR-SSP；人類血小板抗原；基因分型

摘要 目的：建立人類血小板抗原1～4系統序列特異性引物（PCR-SSP）分型方法。方法：合成14條引物，采用PCR-SSP方法對25名健康獻血者的HPA-1～4系統進行基因分型；分型結果與采用等位基因特異性寡核苷酸點雜交（PCR-ASO）獲得的結果進行比較。結果：以PCR-SSP方法對HPA 4個系統進行分型均取得了明確、滿意的結果，且與PCR-ASO方法獲得的結果完全一致。結論：人類血小板抗原PCR-SSP基因分型方法具有簡便、快速、準確等優點，具有廣泛的應用前景。 中圖分類號 Q503 R331.1^＋43 Q343．1 Genotyping of Human Platelet Antigen Systems from 1 Through 4

Lu Zhenyu Liu Dazhuang Bao Yuqin

（Blood Group Reference Laboratory of Shanghai Blood Center）

【Abstract】 Objective:To set up the method of genotypeing the human platelet antigen(HPA)systems from 1 through 4 by sequence-specific primers(PCR-SSP).Methods:14 primers were synthesized so that the human platelet antigen systems from 1 through 4 in 25 healthy blood donors could be genotyped by PCR-SSP method.The reusults of genotyping by PCR-SSP were compared with those obtained by allele-specific oligonucleotide hybridization(PCR-ASO) Results:The results of genotyping the 4 HPA systems by PCR-SSP were definite,satisfied and in complete agreement with those obtained by PCR-ASO method.Conclusion: The PCR-SSP method of genotyping the human platelet antigen has the advantages,such as simplicity,rapidity,accuracy and so on,opening up the broad prospects for its further application.

【Key words】 PCR-SSP;Human platelet antigon;Genotyping

迄今，國際上已報道了9個血小板特異性抗原系統，包括人類血小板抗原(HPA)系統1～8以及 Nak^a抗原^［1～3］。這些抗原都是在血小板輸注和懷孕介導的同種免疫過程中被發現的。在現代臨床輸血工作中，為了能給新生兒同種免疫血小板減少癥(NAITP)、輸血后紫癜(PTP)以及血小板輸注無效(PTR)等患者提供正確、及時的診斷和治療，對病人和獻血者進行血小板特異性抗原的準確分型是重要的。血清學方法是現在最普遍采用的血小板抗原分型方法，但應用一直受到抗血清來源和病人血小板數量的限制。20世紀90年代后，隨著分子生物學技術的不斷發展和對人類血小板抗原基因結構研究的突破性進展，使血小板基因分型更為簡捷準確。筆者采用PCR序列特異引物技術(PCR-SSP)對HPA-1～4這4個比較重要的血小板抗原系統進行了基因分型研究。

1 材料與方法 1.1 樣本 25名健康獻血者靜脈采血0.5ml，ACD抗凝。 1.2 基因組DNA抽提 采用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提DNA。 1.3 引物 DNA序列特異性引物設計參照文獻［4，5］方法，一共12條，合成序列見表1。內對照為人類生長激素（HGH）基因特異性引物，序列： HGH-1s 5' TGCCTTCCCAACCATTGCCTTA 3'；HGH-2as 5'CCACTCACGGATTTCTGTTGTGT-TTC 3'；擴增產物長度為434bp。 表1 PCR-SSP引物序列、長度及其確定的特異性

1.4 PCR-SSP測定方法 每個PCR擴增體系為40μl，其中包括基因組DNA200ng，10×PCR緩沖液(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl ,0.001%明膠), 2.5mmol/L MgCl₂,375mmol/L dNTP,特異性引物各1.0mmol/L，內對照引物各0.2mmol/L,1.25U TaqDNA酶(美國Perkin-Elmer美國)；擴增采用Mastercycler 5330自動循環儀(德國Eppendorf公司)，首先，94℃10min,接著94℃1min，67℃2min(HPA-2、4系統，65℃2min)、72℃1min循環30次，最后72℃延伸10min。 1.5 擴增產物的檢測 取擴增后產物10μl在2％瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.5μg/ml)中電泳，約30min后在紫外儀上觀察電泳條帶，以寶麗來快照記錄結果。 1.6 PCR-ASO 按試劑盒說明書操作，通過ELISA方法進行結果檢測。 2 結果 2.1 PCR-SSP方法分型 25名健康獻血者的HPA-1～4系統PCR-SSP分型結果見表2及附圖。 表2 25名獻血者的HPA-1～4系統PCR-SSP分型結果^*

*與PCQ-ASO分型結果完全一致 M:100bp ladder DNA;*為內對照產物；**為特異擴增產物 附圖 HPA-1～4PCR-SSP方法基因分型的電泳結果 2.2 PCR-ASO方法分型 25名健康獻血者的HPA-1～4系統PCR-ASO分型結果與PCR-SSP分型結果完全一致。 3 討論

隨著成分輸血的深入開展，對HPA分型的需求在日益增長。血清學方法，如混合被動血凝試驗(MPHA)、血小板抗原單克隆特異性抗體固定試驗(MAIPA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)^［4］以及簡易致敏紅細胞血小板血清學試驗(SEPSA)^［6］等于血小板抗體的檢測固然比較簡便，但用于HPA定型則有其不足之處：如血小板抗體血清很難獲得，尤其是抗2a和抗3b血清，而且在一些PTP或PTR病人中較難獲得足夠的血小板用于血清學試驗。近來開始出現的DNA分型方法則克服了這些不足，它不需要血小板抗體和新鮮的血小板，只需要少量的全血或組織便可作HPA基因型分型^［4］ 。應用于HPA基因型分型的分子生物學方法主要有以下幾種：PCR-ASO^［7～9］ 、限制性片斷長度多態性分析(RFLP)^［5］ 、PCR-SSP等。PCR-ASO方法比較繁瑣,且判斷試驗結果不太容易。RFLP方法較PCR-ASO方法簡單，但由于其需要限制性內切酶的使用和消化步驟，故仍然較為繁瑣，且無法對HPA-4系統作基因型分型^［4］ 。PCR-SSP方法允許PCR擴增后，直接凝膠電泳，進行結果判斷，所以較前二種方法簡單、快速和經濟。Tanaka等^［4］使用PCR-SSP方法對HPA-2～4系統作了基因型分型，而Klüter等^［10］對HPA-1～3，5系統進行了分型。筆者亦嘗試以PCR-SSP方法對HPA-1～4這 4個比較重要的HPA系統進行基因分型。通過對PCR中各個反應成分（尤其是MgCl₂濃度）及反應循環條件（尤其是退火溫度和時間）的選定，增加反應的特異性，減少非特異性擴增，逐個系統進行研究，最終建立了HPA-1～ 4系統的PCR-SSP基因分型方法，且PCR-SSP分型的結果與采用PCR-ASO方法獲得的結果完全一致。

本實驗研究結果說明，使用PCR-SSP方法對HPA進行基因分型具有簡單、快速、經濟、準確等優點，故其應用前景廣闊，如能給NAITP、PTP和PTR 患者以及一些血小板單采獻血者作HPA定型，使血小板配合型輸血成為可能，從而提高血小板輸注的安全性及有效性。另外還可以對大規模人群進行HPA基因頻率的調查，有助于進行人類學的研究。當然，還能對孕婦進行篩選，對新生兒同種免疫血小板減少性紫癜的風險作出正確的估計。

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