體細胞雜交實驗

隨著分子遺傳學技術出現，體細胞雜交也取得了重要的進步：作為探針的 DNA 可以從用于體細胞雜交或 Southernblot 的細胞中獲取，而來自相應基因的探針無論是雜交到濾膜，還是雜交到染色體的變性或非變性的片段上，都能被辨別。然而，由于人類與嚙齒目動物在 DNA 和蛋白質水平上的相似性，作為雜交用的片段必須非常特異，以免與嚙齒目動物發生交叉反應。利用這一技術，許多基因被成功定位，但值得注意的是：由于假基因和基因家族的存在，探針在設計時應盡量與該基因的相應片段吻合，以免與這些基因發生交叉反應。

單層全細胞融合實驗

實驗材料 匯合至一定程度的受體細胞

試劑、試劑盒 受體細胞適合生存的培養基合適的選擇性試劑含感興趣染色體及合適遺傳標記的供體細胞

儀器、耗材 10 cm 組織培養板25 cm 組織培養瓶倒置相差顯微鏡

實驗步驟

基本方案 單層全細胞融合

1.倘若不知道細胞的選擇條件，通過以下方式來確定：將培養于 25 cm 培養瓶中的受體細胞傳代，比例為 10:1，分裝于不同培養瓶中，并用不同水平的選擇試劑來培養。

每周 2 次觀察細胞，換液，10d 之后確定抑制細胞生長的試劑的最低濃度。

2.在融合前的當天下午，將等量的供體細胞和受體細胞（通常為 5X105?IXlO6 個) 培養于含 IOml 有血清的培養基中，同時分別將供體細胞和受體細胞培養于含或不含 PEG 的培養基來做對照，培養過夜。

供體和受體細胞在選擇條件下需死亡，含 PEG 的細胞應該在選擇條件下恢復并開始匯合，當一個新細胞系或新的 PEG 使用時，后者的對照需重故。

3.在顯微鏡下觀察細胞，其需 70% 匯合，細胞與細胞之間需接觸良好，但互不擠壓，若細胞量不夠，準備新培養瓶增加培養。

4.將瓶中的培養基吸出，用無血清的培基洗 2 次，并完全將其吸出，將瓶傾斜一段時間同時將最后的培養基吸出。

5.加 2 ml50%PEG 溶液，37°C。將培養瓶來回傾斜使溶液在細胞中快速混勻，讓其站立 2 min(時間非常重要），若有必要，通過以下試驗來優化條件：peg 濃度為 44%~50%; 單層細胞孵育 2~3 min, 懸浮細胞 2~4 min。

6.將 10 ml 無血清培基輕柔地從皿的一邊加人，輕柔顛倒使 PEG 擴散完全，吸出培基并棄去，用無血清培養基重復洗兩次，最后一次用 10 ml 有血清培養基洗，由于細胞膜此時非常脆弱，故以上操作均需輕柔。

7.加人 10 ml 有血清培養基，孵育 36~48 h(在該時間段內使細胞擴增 2 次）。

8.用胰酶消化細胞，將其分至 5~10 個 10 cm 培養板中。為了確保選擇，板中的細胞濃度需低，以保證細胞在匯合之前能分裂幾次。在每個板中加入 10 ml 有血清培養基和合適濃度的選擇性試劑（第 1 步），在 37°C 中孵育。

9.每 5d 換一次液直至長出克隆，換了選擇性培基后 10?14d 后確認皿中是否有克隆長出。避免損壞細胞或使其長得越來越大，因為移動細胞可能使其長出姐妹克隆。

10.用挑克隆的針將克隆挑出（支持方案 1)。

11.為了避免維持和擴增不需要的細胞系，一旦克隆長出，立即擴增、鑒定（第 3~5 步）及凍存（附錄 31)。為避免染色體缺失和重組，傳代需少（三代以內細胞使用一個凍存管，1 個 6 cm 培養皿使用 2 個凍存管）。在鑒定細胞系時，需使用多種鑒定方法，在復蘇和擴增時需重新鑒定以確保無染色體重組和分離。若有必要，對已分離出額外染色體的細胞系挑亞克隆（支持方案 2)12. 在快速復蘇時，將細胞培養至 25 cm 組織培養瓶中，若細胞在凍存后恢復較慢，則增加凍存培養基中的血清含量。

備選方案 懸浮培養供體細胞-單層的供體細胞的全細胞融合

1.消化貼壁生長的受體細胞，在培基中重懸，用血細胞計數器對供體細胞和受體細胞計數，分別取 2XIO 6 個，在 15 ml 扣蓋的聚丙烯試管中混勻，維持以確保選擇有效。

2.室溫 400 g 離心 5 min，在受體細胞中加入 IOml 無血清的培基，再次離心，小心吸出培養基，將試管傾斜以吸干培養基。

3.輕彈試管使團塊松散。用移液器吸取 0.3 ml 50% PEG 溶液，37°C，沿管壁加人同時輕搖或輕彈試混勻。室溫孵育 3 min。如有必要，可以優化融合條件（基本方案，第 5 步）

4.加入 8 ml 無血清培養基，立即 400g 離心 5 min。

5.小心吸出培養基，再用 IOml 無血清培養基重懸細胞。再次離心。室溫下，吸出培養基，用 IOml 血清培養基重懸細胞。洗的過程中要格外小心，因為此時細胞的膜很脆弱。

6.加 3 ml 細胞懸液到每個 IOOmm 組織培養板內。加 ImI 細胞懸液到另一 100 mm 培養板內，作為對照。孵育 36~48 h。

7.用加血清和篩選因子的培養基培養細胞（用未加篩選因子作對照）。

8.準備克隆及其鑒定（基本方案，第 9~12 步）