免疫學測定技術的應用與研究進展

現代免疫學測定技術源于標記技術的發展。繼1941年Coons等創立熒光素標記抗體技術(f1uorescent antibody technique)以來，上個世紀50年代末60年代初,Yalow等創立了放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)技術，1966年由美國和法國學者又同時報道建立了酶免疫測定技術(enzyme immunoassay,EIA),包括:酶免疫組化技術,固相酶免疫測定(如ELISA,western blotting)和均相酶免疫測定(又稱酶放大免疫分析技術,EMIT)。另一傳統標記技術為膠體金標記免疫分析始于上個世紀80年代，除應用于免疫電鏡外，廣泛用于免疫滲濾和免疫層析試驗[1]。除此之外,目前又相繼報道建立了一些新型標記免疫測定技術,如元素標記免疫測定，核酸標記免疫測定和量子點標記免疫測定技術。這些技術及由此衍生的實驗方法有些已在臨床免疫學檢驗中得到了廣泛的應用，有些尚處于研究和探索階段。本文主要就相關技術的應用及進展綜述如下。
1．熒光素標記的免疫測定技術
1．1 間接免疫熒光技術(IFA) 長期以來用作細胞內抗原定位或相應抗體檢測的“金標準”,適合用作篩查實驗,主要用于抗核抗體(ANA)、抗ds-DNA抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)等自身抗體,及某些病原體如EB病毒、SARS病毒、軍團菌及其他呼吸道病原體抗體的檢測等[2,3]。目前已有商品化的全自動操作系統,可以自動完成對樣品的稀釋、加樣、溫育、洗滌等過程。最后借助于激光共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡觀察結果。其技術特點是減少手工操作可能造成的偶然誤差，提高了免疫試驗的標準化和自動化程度，縮短了實驗所需的時間。
1．2 流式細胞免疫熒光分析(FCM) 該技術借鑒了熒光抗體與血細胞分析儀原理, 經歷了從相對細胞計數到絕對細胞計數, 從細胞膜成份到細胞內成份, 從單色熒光到多色熒光的發展歷程, 并將分子表型與免疫表型分析相結合, 因而成為細胞分析和分選的重要工具[4]。其工作流程包括標本處理與熒光染色, 激光聚焦檢測, 流動控制, 信號的處理與放大, 以及計算機分析和結果打印。在細胞表型 (celluar phenotype)分析、DNA含量與細胞周期分析、細胞內及核膜成分分析及細胞分選等領域有著廣泛的應用。
1．3 以熒光標記為基礎的四聚體分析技術 該技術主要是基于MHC/抗原肽復合物與T細胞表面受體(TCR)相互作用的原理而設計的。首先選擇某一抗原特異性Ｔ細胞所識別的抗原表位肽以及與該表位肽結合的HLA分子，使之形成HLA-肽復合物，進一步生物素化后再與特定熒光素(如PE)標記的鏈霉親合素按照一定比例混合，如此構建的四聚體即可通過其本身MHC分子提呈的表位肽與Ｔ細胞表面的TCR進行精確識別和高親和力結合而達到檢測抗原特異性T細胞的目的[5]。由其衍生的主要技術類型包括:(1)MHC-肽四聚體流式細胞術，特點是快速、敏感、特異，可計數所有抗原特異性Ｔ細胞,不管這些細胞是原始的或效應的,有功能的或無功能的;(2)原位MHC-肽四聚體染色法(IST)，又可分為直接法和間接法兩種，用于組織切片染色，檢測抗原特異性T細胞在空間和時間上的分布;(3) MHC-肽四聚體磁分離技術，分離的抗原特異性T細胞可用于進一步分析其生物學功能;(4)MHC-肽四聚體ELISA法;(5)MHC-肽四聚體分子微陣列技術。上述以熒光標記為基礎的四聚體分析技術均已應用于病毒(如HBV、HCV和HIV等)抗原、腫瘤抗原特異性Ｔ細胞和自身免疫病相關的自身反應性T細胞(ART)的測定和研究中。