免疫組化實驗原理和步驟（四）

免疫組化染色注意事項

免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實際工作中不斷摸索和探討的事，但最基本的應從以下方面加以注意：

（1）去除內源酶及內源性生物素

一般我們進行免疫組化標記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內源酶和內源性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標記抗體癿，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標記抗體的過氧化酶進行人組織切片之前就應設法將組織內的內源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進行。

1) 去除內源酶

常用的去除內源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細胞的標本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能不過氧化氫反應，出現氣泡現象，易對組織結構和細胞形態產生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內源性酶，即使有些血細胞在顯色后也出現棕黃色反應，但由于其形態結構不組織細胞不同，也易鑒別，而此方法比較通用易操作，但應注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為3%一5%，時間不宜過長，最好室溫10min。

2) 去除內源性生物素

在正常組織細胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應用親和素試劑的染色中，內源性生物素易結合卵白素，形成卵白素一生物素復合物，導致假陽性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結合位點飽和，以消除內源性生物素的活性。

3）滅活堿性磷酸酶

最常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6-8.2，能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對亍仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。

（2）抑制非特異性背景著色

非特異性著色最常見的情況是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結締組織成分上，而出現背景著色，為了防止這種現象，最好用特異性抗體來源的同種動物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進行處理，以封閉荷電點，不讓一抗結合，但這種方法一般實驗室很難實現，一般常見實用的血清是2%-10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10-30min即可，但應注意此種結合是不牢固結合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對于多余的隆抗體來講，易產生背景著色，在稀釋特異性抗體時可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。

（3）緩沖液

免疫組化染色標記是對生物體組織抗原進行標記，抗原抗體最合適的pH值為7.2-7.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡易配法：5000ml蒸餾水中分別加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標記物底物的方法時可以用0.02mol/L TBS pH8.2緩沖液比較好。

（4）抗原修復

經甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低，這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時，有些抗原需先進行修復或暴露。

抗原修復方法可分為化學方法和物理方法。化學方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度不消化時間要適度。常用癿物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。

在選用這三種加熱法時，浸泡切片癿緩沖液的離子強度和PH值、加熱的溫度和時間均影響著抗原修復效果。目前最常用的修復方法有如下凡種：

1）胰蛋白酶(Trpsin)

主要用于細胞內抗原的修復。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(無水)水溶液中溶解后即可。

2）胃蛋白酶(Pepsin)主要用于細胞間質或基底膜抗原的修復。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。

3）熱引導的抗原決定簇修復(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)

HIER對大多數的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，最常用的抗原修復液是pH6.0的檸檬酸緩沖液和pH8.0癿EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現的。抗原修復液的pH值非常重要，有效的抗原修復pH值要比修復液的化學成分。

更重要，同樣的修復液隨著pH值的升高染色的強度逐漸增強，但最佳pH值范圍為6.0-10.0，對于大多數抗原這個范圍癿pH值都能進行有效的修復，有些抗體(如Ki-67、ER)則在pH值l.0-3.0和6.0-8.0更為有效。作為通用修復液堿性pH值的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH值的修復液則優亍堿性的修復液，所以兩種抗原修復液可作為相互替補的進行抗原修復。在進行HIER過程中應防止切片的干燥，加熱時必須達到預定的溫度，保溫時間要足夠，對于一些不要抗原修復的抗體最好不要采用HIER處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復聯合應用。

HIER方法有：

1）水浴加熱法:將脫蠟人水后的切片放人盛有修復的容器中，放人加熱煮沸水中，當修復液溫度達到95℃左右時計時l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。

2)微波加熱法:將切片放入修復液中微波加熱使溫度在96℃左右，計時l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。

3)高壓加熱法:將修復液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使修復液淹沒切片)開始噴氣時蓋上壓力閥。計時2min，況水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。

（5）顯色

免疫組化染色的顯色是最后的關鍵問題，一般辣根過氧化物酶(HRP)的檢測系統選用DAB或AEC顯色系統進行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴格控制，以檢出物達到最強顯色而背景無色為最終點，尤其DAB顯色時間短著色淺，時間長背景又深，都將影響結果判斷，根據經驗DAB在配制完后最長宜放置30min以內，過時不能使用，DAB加到組織切片時作用時間最長不宜超過10min(最好在5min內)，否則不管有無陽性都應終止反應。對一些含有內源性酶較高的組織用DAB顯色時極易出現背景色更應盡早在鏡下控制，以達到最佳的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶(AP)最好選用NBT/BCIP作為顯色系統（結果染為藍黑色）。