實驗概要
本說明適用于沒有全自動染色機或 capillary gap system（如 Shandon Sequenza）等的實驗室。可用移液器人工加試劑，也適用于全自動或半自動系統。
培養箱應配備有加濕器避免組織變干。變干發生在任何階段最后都會導致非特異性染色及高背景染色。帶密封蓋的淺塑料盒，底部鋪上濕紙巾就是一個加濕裝置。玻片只要不貼緊紙巾且平放就不會變干。一個好的解決辦法就是將一根塑料輸液管切割成若干適合恒溫箱的小段，用膠成對地粘到恒溫箱底部，每對管之間間隔 4 cm，這樣能給玻片一個平穩及升起的小平臺，使玻片直接接觸濕紙巾。
一抗和二抗的最佳稀釋度可以從說明書中獲得，或者通過試驗獲得。根據所獲得的結果調節至最佳稀釋度。孵育時間要嚴格遵照說明書的建議。
辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 是酶解法中最為常用的酶。這些酶的底物較多。
實驗步驟
1. 第一天
1) 若使用 HRP 標記二抗檢測，則需要封閉內源性過氧化物酶，但我們建議在開始一抗孵育前不予理會。
2) 在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 中漂洗玻片 2×5 分鐘 ，輕輕震蕩。
3) 用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室溫封閉 2 小時。控干封閉液（不是漂洗），并用紙巾將玻片周圍擦干。
4) 一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀釋后加到玻片上。
5) 4 °C 孵育過夜。
2. 第二天
1) 用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分鐘，并輕輕震蕩。
2) 若使用 HRP 標記二抗檢測，則需將玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分鐘以封閉內源性過氧化物酶。
3) 酶法檢測（HRP 或 AP 標記二抗）：
4) 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分鐘。
5) 若采用熒光檢測，則結束此步后就可以用封固劑和蓋玻片進行封固了。
6) 若采用底物顯色，則還需繼續進行下述操作。
7) 室溫下與底物作用 10 分鐘。
8) 流水沖洗 5 分鐘。
9) 復染（如果需要）。
10) 脫水，擦干并封固。
注意事項
1. 二抗可能會與組織內的內源性免疫球蛋白發生交叉反應。以二抗同種動物來源的正常血清預處理組織，可減少這種作用。加一抗前先與正常血清孵育也可消除 Fc 受體與一抗和二抗結合。抗體稀釋緩沖液中的 BSA 能降低疏水作用引起的非特異結合。 如果組織樣品經醛類如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定后用免疫熒光法 (IF) 檢測，在加一抗前要用含 0.3M 甘氨酸的封閉液封閉。因為甘氨酸能結合自由醛基，否則這些醛基會與一抗和二抗結合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定時，有可能由于自由醛基導致高背景。
2. 一抗應稀釋到廠家推薦的最佳稀釋度或者曾經篩選到的最佳稀釋度。如果沒有起始稀釋倍數，我們建議按下述操作。大多數 IHC-P 抗體的使用濃度在 0.5-10 μg/ml 之間。要確保一抗和被染色的組織來自不同物種。 例如，小鼠組織，一抗來自小鼠，抗鼠 IgG 二抗會與小鼠組織中的所有內源性 IgG 結合，導致高背景染色。將小鼠單克隆抗體用于小鼠組織將在我們小鼠-對-小鼠說明書中討論。
3. 過夜孵育可以使低親和力的抗體有較長的時間結合到抗原上。然而，不論抗體親和力的高低，一旦抗原抗體結合達到飽和或平衡，將不會再發生結合。因此，過夜孵育確保了結合達到平衡。
4. 過氧化氫 (H2O2) 能抑制內源性過氧化物酶活性從而降低背景染色。組織切片至水后，在 DAB（3,3’二氨基鄰苯胺底物）溶液中孵育，能檢測是否存在內源性過氧化物酶。如果切片在顯微鏡下出現棕色區域，說明存在過氧化物酶，應該做封閉。由于過氧化氫能修改一部分抗原表位，減少了抗原抗體的結合，因此可在初步孵育切片后再與過氧化氫孵育即可避免此問題。用 TBS 或水稀釋過氧化氫。有些實驗室用甲醇稀釋，甲醇更適合于血涂片或其它富含過氧化物酶的組織如肝臟。甲醇稀釋過氧化氫可減少在水溶液中反應時對組織的損壞。對于其它組織，我們建議使用 TBS 或水，因為甲醇/過氧化孵育后會降低一些抗原抗體的結合，特別是對于細胞表面蛋白來說。 內源性過氧化物酶的封閉只用于過氧化物酶標記物如 HRP。
5. 觀察組織和細胞形態所用的復染劑通常是蘇木精（藍色）、核固紅或甲基綠。采用熒光檢測法時，復染用 DAPI（藍色）或碘化吡/PI（紅色）。
6. 切記 DBA 是一種致癌物，操作時要穿上有效的防護服。與次氯酸鈉在密封容器中過夜可弱化它的致癌作用（相互作用產生有害氣體），再根據實驗室操作規程處理。如果使用 AP，取 0.24 mg/ml 的左旋四咪唑加到染料溶液中，可抑制內源性磷酸酶活性，降低背景染色。
7. 如果使用 AEC、固紅、INT 或其它水溶性染料，切記它們溶于醇類溶劑，要選用合適的水溶性封片劑。切勿進行步驟 9 中的脫水擦干。
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