免疫細胞化學(ICC)

實驗概要

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。  免疫組化技術近年來得到迅速發展。50年代還僅限于免疫熒光技術，50年代以后逐漸發展建立起高度敏感，且更為實用的免疫酶技術。

實驗步驟

1.   固定

1)   冷甲醇、丙酮固定樣品 1-10 分鐘，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室溫固定 15 分鐘。

2)   冷 PBS 沖洗樣品 2 次。

2.   通透

1)    將樣品在含 0.25% Triton X-100 (或 100 μM 洋地黃皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10  分鐘。Triton X-100 是最常用的去污劑，能增強抗體的穿透力。因為它對細胞膜有損壞作用，因此不適用于與細胞膜結合的抗原。

2)   PBS 沖洗細胞 3 X 5 分鐘。

3.   封閉及孵育

1)   細胞在含 1% BSA 的 PBST 中孵育 30 分鐘，以阻斷抗體的非特異性結合（封閉液也可以選擇含 1% 明膠或 10% 與二抗同種動物來源的血清）。

2)   細胞與抗體（含 1% BSA 的 PBST 稀釋）在濕盒中共同孵育，室溫 1 小時，或 4 °C 過夜。

3)   棄去液體，PBS 沖洗細胞 3 X 5 分鐘。

4)   細胞與二抗在 1% BSA 中孵育，室溫 1 小時，避光。

5)   棄去二抗溶液，PBS 沖洗細胞 3 X 5 分鐘，避光。

4.   復染

1)   0.1-1 μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色劑）孵育細胞 1 分鐘。

2)   PBS 沖洗。

5.   封固

1)   向蓋玻片上滴加一滴封固液封固。

2)   用指甲油密封蓋玻片防止變干并移至顯微鏡下觀察。

3)   -20 °C 或  4 °C 避光保存。